A V(D)J-rekombináció [1] vagy V(D)J-rearrangement [2] ( eng. V(D)J-recombination, V(D)J rearrangement ) a szomatikus DNS - rekombináció egyik mechanizmusa, amely a limfociták differenciálódásának korai stádiumai , és antigén - felismerő szakaszok kialakulásához vezetnek az antitestek és a T-sejt receptorok . Az immunglobulinok ( angolul Ig ) és a T-sejt receptorok ( angolul TCR ) génjei három osztályba tartozó ismétlődő szegmensekből állnak: V (az angol változóból ), D ( angol változatosságból ) és J ( angolul .joining ) . A V(D)J átrendeződés során minden osztályból egy-egy génszegmens egyesül. A V(D)J szegmensek kombinált szekvenciája az egyes receptor- vagy antitestláncok variábilis doménjeit kódolja [2] .
Az antitest (immunglobulin) molekula két azonos nehéz (H-lánc) és két azonos könnyű lánc (L-lánc) tetramerje . Mindegyik láncnak van egy N-terminális variábilis régiója (variábilis vagy V-domén) és egy konstans régiója (konstans vagy C-domén) a C-terminálison . A variábilis domén részt vesz az antigénfelismerésben , a C-domén pedig az effektor funkciókért. Ahogy a neve is sugallja, a V domén aminosavszekvenciája változó, míg a C domén kifejezett konzervativizmust mutat . A maximális variabilitás pontosan az antigénkötésért felelős régióban nyilvánul meg [3] . Az antigénkötő helyet nehéz és könnyű láncok V-doménjei alkotják (V H - illetve VL -domének ) [4] . Az L lánc egy C domént tartalmaz (C L jelöléssel), a H lánc pedig 3 vagy 4 domént tartalmaz, amelyek jelölése CH 1, CH 2, CH 3, CH 4. A C domének nem vesznek részt az antigénfelismerésben és szükségesek az immunsejt- receptorokkal való kölcsönhatáshoz, a komplementrendszer aktiválásához és más effektor funkciókhoz [5] .
A legtöbb géntől eltérően az immunglobulin és a T-sejt receptor gének nincsenek teljes egészében jelen a csíravonalban és a szomatikus sejtekben . A V- és C-domént kódoló egyetlen gén kialakulása egy (könnyű láncok esetében) vagy két (nehézláncok esetén) szomatikus rekombinációs aktus révén megy végbe. A V- és C-doméneket a V-gén és a C-gén külön szegmensei kódolják, és nem expresszálhatók önmagukban: ebben a rendszerben két "gén" egyetlen polipeptidet kódol - könnyű vagy nehéz. lánc. A sok V génszakasz bármelyike kapcsolódhat több C génszegmens bármelyikéhez. A könnyű láncok egyetlen rekombinációs aktus eredményeként jönnek létre. Kétféle könnyű lánc létezik: κ és λ. A λ könnyű lánc a V λ gén és a J λ C λ szegmens rekombinációjával jön létre . A J betűt a V λ szegmens összekapcsolásának helyeként rövidítjük, vagyis a kapcsolódási reakció nem közvetlenül a V λ - és C λ - szegmensek között megy végbe, hanem a J λ szegmensen keresztül . Ez a szegmens a variábilis régió több aminosav-oldalláncát (a.o.) kódolja, és a rekombinációval létrejött génben a V λ -J λ szegmens egyetlen exon , amely a teljes variábilis régiót kódolja. κ típusú könnyű lánc esetén a lánc is két szegmensből áll össze, azonban a V κ gén után egy öt szegmensből álló J κ csoport következik , amelyet a C κ exontól egy 2 intron választ el. 3 ezer bázispár hosszú . A rekombináció során a V κ szegmens bármelyik J κ szegmenshez kapcsolódhat, és az ép változó exon végső soron a V κ és J κ szegmensekből áll . A rekombináló J κ -szegmenstől balra elhelyezkedő J κ -szegmensek eltávolításra kerülnek, a rekombináló szegmenstől jobbra lévő J κ -szegmensek pedig a változó és konstans exonok közötti intron részévé válnak [6] .
A nehézláncok nem egy, hanem két rekombinációs aktus eredményeként jönnek létre, és olyan elemek vesznek részt a kialakulásukban , mint a V H gén, a D szegmens és a V H CH génszegmens . A D-szakasz 2-13 a. o., elválasztva a V H -szegmenst és a J H -szegmenst kódoló szekvenciákat. A D-szegmensek helye a kromoszómán szintén a V H -szegmensek és a J H -szegmensek halmazai között található. A V H -DJ H kombináció két szakaszban történik: először az egyik D szegmens kapcsolódik a J H szegmenshez, majd a V H - szegmens rekombinálódik a kombinált DJ H szegmenssel . A három VH -DJ H elemből álló szekvencia együtt expresszálódik a CH génnel , amely a VH-DJ H jobb oldalán található, és négy exont tartalmaz. Emberben a D-szegmens lókusz 30 D-szegmensből áll egymás mellett , amit egy 6 J H szegmensből álló klaszter követ . Még mindig nem ismert, hogyan biztosítható , hogy ugyanaz a D-szegmens részt vegyen a DJ H és a V H -DJ H rekombinációs eseményekben . Az egyes elemek elnevezése szerint a könnyű vagy nehéz láncot kódoló egyetlen lókusz összeállításának folyamatát V(D)J-rekombinációnak nevezték [7] .
A T-sejt receptor ( TCR ) két alegység heterodimerje : α és β (TCRαβ receptor) vagy γ és δ (TCRγδ receptor), amelyek a TCRA, TCRB, TCRG és TCRD géneket kódolják. Bár a TCR δ-láncot kódoló szekvenciák az α-lánc génen belül helyezkednek el, általában különálló genetikai klaszternek tekintik őket . Az immunglobulinokhoz hasonlóan a T-sejt receptor konstans doméneket és azokat kódoló C-géneket, V-géneket kódoló V-doméneket, valamint C-gének és V-gének klasztereit elválasztó J-szegmenseket (a TCRB ill. A TCRD gének D-szegmensei is jelen vannak). A négy lehetséges TCR-lánc mindegyikének kialakulása során V(D)J rekombináció is megtörténik [8] . A D szegmenseket tartalmazó TCRB és TRCD gének esetében a rekombináció két szakaszban történik (először a D és J szegmensek között, majd a DJ és V szegmensek között), a TCRA és TRCG esetében pedig egy szakaszban [9] .
Így csak hét génlókusz van kitéve V(D)J átrendeződésnek: az immunglobulin nehéz lánca (IgH), a κ és λ könnyű láncok, valamint négy T-sejt receptor gén, amelyek az α, β, γ, δ láncokat kódolják: TCRA, TCRB, TCRG és TCRD. A D-szegmensek csak az immunglobulin nehézlánc génjében, a TCRB-ben és a TCRD-ben vannak jelen [10] .
Az antigénfelismerésben részt vevő összes polipeptid lánc V-génje átrendeződésen megy keresztül, de nem egy időben, hanem egymás után. A B-sejtekben először a nehézlánc gének, majd a könnyűlánc gének rendeződnek át (először a K-típusú könnyűláncok, majd a λ-típusú könnyűláncok rendeződnek át). A T-sejtekben a TCRαβ gének kialakulása során először a β-, majd az α-lánc gének rendeződnek át. A TCRγδ esetében a γ- és δ-láncok variábilis doménjeinek génjeinek átrendeződése szinte egyidejűleg megy végbe [11] .
A V(D)J rekombináció csak a T- és B-sejtekben fejeződik be a külső környezetből származó differenciálódási jelek hatására. A DJ-rekombináció formájában bekövetkező átrendeződés kezdeti stádiumai olyan sejtekben is előfordulhatnak , amelyek nem kapcsolódnak a T- és B-sejtekhez, például a természetes ölőkhöz , amelyek közel állnak a T-sejtekhez [12] . Az immunglobulinok vagy a T-sejt receptorok mind a hét lókuszának V(D)J rekombinációjának molekuláris mechanizmusa azonos [13] . A V(D)J rekombinációs reakciók sorrendjét az előző részben ismertetjük, és itt ismertetjük a V(D)J rekombináció molekuláris mechanizmusait is.
A rekombináció a génszegmensekkel közvetlenül szomszédos DNS-szignálszekvenciákon megy végbe. Ezeket a konzervált szekvenciákat rekombinációs szignálszekvenciáknak ( angolul rekombinációs jelszekvencia , RSS) nevezik, és hét nukleotidból állnak - 5'-CACAGTG-3' ( heptamer ), amelyet egy 12 vagy 23 nukleotidból álló szekvencia követ - egy spacer , és több egy, kilenc nukleotidból álló konzervatív blokk - 5'-ACAAAAACC-3' (nonamer). A spacer szekvenciája változhat, de a hossza konzervatív, és a DNS kettős hélix egy (12 nukleotid) vagy két (23 nukleotid) fordulatának felel meg Átrendeződés csak két RSS között történik, amelyek közül az egyik 12 bázispár (bp), a másik egy 23 bp távtartó, az úgynevezett "12/23 rekombinációs szabály". Az RSS szerkezetének ez a mintája határozza meg a helyes rekombinációs szekvenciát: például az IGH lókusznak van egy 23 bp RSS-je. minden V szegmens 3' végén, 12 bp hosszú RSS. mindegyik D szegmens 3' és 5' végén, és egy 23 bp RSS. minden J szegmens 5' végén. Így ennek a lokusznak a VJ átrendezése nem lehetséges. A konszenzus szekvenciák V- vagy J-szegmensekben tetszőleges elrendezésűek lehetnek, vagyis a különböző spacerek csak arra szolgálnak, hogy megakadályozzák a V- vagy J-szegmens rekombinációját ugyanazzal a szegmenssel, és nem hordoznak jelentős információt [14] .
A RAG1 és RAG2 ( rekombinációs aktivációs gének ) fehérjék szükségesek és elegendőek a DNS-törések beiktatásához a V(D)J rekombináció során . A RAG1 és RAG2 géneket nem tartalmazó egerekben csak éretlen T- és B-sejtek vannak, mivel nem képesek funkcionális antitesteket és T-sejt-receptorokat képezni. A RAG1 a megfelelő 12 vagy 23 bp-os spacerekkel rendelkező jelszekvenciákat ismeri fel. és beszervezi a RAG2-t a reakciókomplexbe. 9 p jelsorozat. az elsődleges felismerés helye, és a szekvencia 7 bp. jelzi a vágás helyét. A RAG1 és RAG2 dimerizációja következtében a hozzájuk kapcsolódó szekvenciák közelednek egymáshoz, amit a jelszekvenciák közötti komplementer kölcsönhatások is elősegítenek, amelyek palindromicitásuk miatt lehetségesek . A HMG1/2 heterodimer részt vesz a RAG1 és RAG2 szekvenciák konvergenciájában is. A RAG1/2 komplex egy-egy száltörést vezet be mind a két régióban, amelyek rekombinációval egyesülnek. A két egyszálú megszakítások végén egy 5'-terminális foszfátcsoport és egy 3'-terminális hidroxilcsoport (3'-OH) található. A kódoló szegmenssel szomszédos 3'-OH megtámadja az foszfodiészter kötést a megfelelő helyen a DNS-duplex másik oldalán. A reakció eredményeként minden egyes egyszálú törés helyén egy hajtű képződik , amelyben a DNS-hélix két szála közül az egyik 3'-vége kovalensen kapcsolódik a DNS-hélix 5'-végéhez. a duplex második szála. A kódoló szegmensek végén lévő hajtűket a Ku70 és Ku80 fehérjék heterodimerje ismeri fel , az Artemis fehérje pedig kinyitja a hajtűket. Továbbá a kódoló szegmensek végeit ugyanaz a mechanizmus köti össze, mint a DNS-javítás során a végek nem homológ összekapcsolásakor . Ha a DNS-lánc megszakad a hajtűvég közelében, akkor a kódoló szegmens végén egy hosszú egyszálú régió képződik. Ezután elkészül egy vele komplementer lánc, és a kódoló szegmens végének régiójába több további nukleotidot vezetnek be, amelyek az eredetihez képest palindrom szekvenciát alkotnak (ezért nevezik őket az angolból P-nukleotidoknak). palindrom ). A kódoló szegmensek közötti további nukleotidok egy másik folyamatból is származhatnak. A terminális dezoxinukleotidil -transzferáz (TdT) enzim kis mennyiségű (legfeljebb 20, általában kevesebb, mint 10) további véletlenszerű nukleotidot (N-nukleotidot) visz be a szegmensek végei közé, majd azokat egy nem homológ végcsatlakozási útvonalon ligálják. [15] . Az RSS szignálszekvenciákat tartalmazó vágott szakasz bezárul, és egy gyűrű alakú struktúrát alkot, amelyet rekombinációs kivágási körként ismerünk (REC az angolból. Recombination excision circle ) [9] .
A kódoló szegmensek végeinek újraegyesülése a nem homológ végcsatlakozás mechanizmusával történik, a DNS ligáz IV, DNS-függő protein kináz , Ku70/Ku80, XRCC4 fehérjék és a nem homológ végcsatlakozási faktor 1 enzimek részvételével. [16] . Ezzel befejeződik az immunglobulinláncot vagy TCR-t kódoló gén összeállítása. A DNS-függő protein kináz részt vesz az Artemis hajtűt feloldó fehérje aktiválásában foszforiláción keresztül [17] . A RAG1, RAG2, DNS-függő proteinkináz, DNS-ligáz IV, TdT, HMG1/2 és Ku70/Ku80 fehérjék kombinációját V(D)J-rekombinációs komplexnek nevezik [18] .
A V(D)J rekombinációnak köszönhetően a gerincesek testében számos antitest jön létre . Egy nehézlánc-lókusz önmagában több mint 108 különböző VH- JH - CH kombinációt eredményezhet . A könnyűlánc lókuszok körülbelül egymillió rekombinált λ vagy κ típusú láncot hozhatnak létre [19] . A vérben lévő antitestek teljes spektrumát 2008-ban George Church javasolta V(D)J-th kifejezésnek [20] .
Egyes esetekben a V(D)J rekombináció inverziókhoz vagy deléciókhoz vezethet . Tehát néha a λ típusú könnyű láncok lokuszaiban a V λ szegmens orientációja a kromoszómán ellentétes a J λ -C λ lókusz orientációjával , és a törés és újraegyesülés ebben az esetben a a deletált hely inverziója jelszekvenciákkal a kromoszómából való kivágás helyett (deléció). Az inverziónak az immunrendszerre gyakorolt funkcionális következményei nem térnek el a delécióétól. Az inverzió útján történő rekombináció a TCR-lókuszokon, nehézláncokon és κ-típusú könnyűláncokon megy végbe [21] .
Ha egy adott V gén átrendeződése sikeres, a RAG gének expressziója leáll, és a homológ kromoszómán lévő gén átrendezetlen marad és nem működik. A sikertelen V(D)J rekombinációs események körülbelül kétharmada a kereteltolódás következménye . Ha az átrendeződés sikertelen, a homológ kromoszómán megindul a V(D)J rekombináció , és ha ez sikeresen befejeződik, akkor a homológ kromoszómán lévő gén marad az egyetlen működőképes, azaz allélkizárás következik be . Az esetek 45%-ában a V(D)J rekombináció sikertelen a limfocita mindkét kromoszómáján, és apoptózissal elhal . Az αβ-TCR esetében, amikor az α-lánc génátrendeződés sikertelen, a szerkesztési folyamat újraindul, és a RAG gén újra expresszálódik. A rekombináció a Vα szegmens részvételével folytatódik, amely nem került kivágásra a kromoszómából, és nem került be a kimetszőgyűrűbe. A folyamat addig ismételhető, amíg a könnyű láncot kódoló funkcionális gén létre nem jön. Terhesség alatt vagy amikor egy T-sejt felismer egy saját antigént , előfordulhat, hogy az α-lánc gén megváltozik . Ha szerkesztjük az α-lánc gént, amely egy homológpár második kromoszómáján a csíravonal konfigurációban van, akkor olyan helyzet állhat elő, amely megsérti az allélkizárási szabályt: egy T-sejtben két azonos TCR lesz. β-láncok, de különböző α-láncok [22] .
A V(D)J rekombináció megsértése immunhiányos állapotok kialakulásához vezet. Súlyos kombinált immunhiányos szindrómában a V(D)J rekombináció szintje az immunglobulinokat és T-sejt receptorokat kódoló lókuszokban nagyon alacsony. A súlyos kombinált immunhiányos szindrómát olyan mutációk okozzák , amelyek nem működő V(D)J rekombinációs fehérjéket hoznak létre: RAG1, RAG2, Artemis vagy DNS-függő protein kináz [23] [17] .
Az immunglobulin molekulában konstans és variábilis domének jelenlétére vonatkozó adatok alapján Dreyer és Bennett 1965-ben azt javasolta, hogy két gén, a V és a C vesz részt egyetlen immunglobulin nehéz vagy könnyű lánc felépítésében [24] . 1976-ban Suzumi Tonegawa kísérletsorozatba kezdett, és kimutatta, hogy az antitesteket kódoló gének olyan átrendeződéseken mennek keresztül, amelyek az antitestek hatalmas változatosságát hoznak létre [25] . 1987-ben Tonegawa fiziológiai és orvosi Nobel-díjat kapott az antitestek sokféleségének mechanizmusának felfedezéséért [26] .
| Limfocita adaptív immunrendszer és komplement | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Nyirokfa |
| ||||||||
| Limfociták | |||||||||
| Anyagok | |||||||||