A cirkuláris RNS ( eng. Circular RNA, circRNA ) az RNS - molekulák egy fajtája , amelyek végei a terminális nukleotidok közötti kovalens kötéssel záródnak egymáshoz . A CircRNS-ek intronokból vagy az érlelő transzkriptum különböző régióiból való hurkolással képződhetnek . Bár a cirkuláris RNS-eket általában nem kódoló RNS- ek közé sorolják, egyre több bizonyíték van arra vonatkozóan, hogy képesek peptideket kódolni [1] . A cirkuláris RNS-ek specifikus funkciói nem teljesen ismertek, de valószínűleg részt vesznek a génexpresszió szabályozásában . A cirkuláris RNS-ek különösen nagy mennyiségben fordulnak elő az agyban , és szabadon keringenek a vérplazmában . Talán a jövőben a körkörös RNS-eket biomarkerként fogják használni a különböző típusú rákoknál .
Elméletileg a cRNS-t három különböző módon lehet előállítani. Először is, a splicing során az intronokat nem lineáris fragmentumként, hanem lasszóként távolítják el az érlelő transzkriptumból. Ha levágja a „farkot” erről a lasszóról, kör alakú RNS-t kap. Az ilyen intronikus cirkuláris molekulák főként a sejtmagban halmozódnak fel, és ciRNS-nek nevezik őket (az angol cirkuláris intronikus hosszú nem kódoló RNS-ekből ). Másodszor, az érlelő transzkriptumban az egyes exonok hurkolhatnak ki, és az ilyen hurkokat a spliceoszóma kivághatja, és kovalensen gyűrűvé zárhatja. Így jönnek létre a körkörös RNS-ek, amelyek csak egy exonból állnak. A cirkuláris RNS-ek, amelyek kizárólag egy vagy több exonból állnak, az ecircRNS-csoportba csoportosulnak (az angol exonic cirRNS-ekből ), és általában a citoplazmában találhatók . Harmadszor, egy több intront és exont tartalmazó régió hurkolhat ki. Ha egy ilyen hurkot kivágunk és lezárjuk egy spliceoszómával, akkor exonokat és intronokat egyaránt tartalmazó cirkuláris RNS-ek keletkeznek. Főleg a sejtmagban lokalizálódnak, és EIciRNS-nek nevezik (az angol exon-intron cirrRNS-ből ). Ezek a molekulák tovább tudnak kapcsolódni, és az intronok eltávolítása után több exonból álló, cirkuláris RNS-t fognak termelni [2] .
Az átirat hurkolt szakaszainak spliceoszómája általi kivágási folyamatot backsplicingnek nevezzük . Az egy exont körülvevő intronok gyakran tartalmaznak egymással komplementer invertált ismétlődéseket , amelyek hidrogénkötéseket képezve a hurok „szárát” alkotják. Hurkolás történhet speciális fehérjék részvételével : egy ilyen fehérje két monomerje a leendő hurok két végéhez kötődik, dimerizálódik , és összehozza a végeket, hogy a spliceoszóma kovalensen keresztkösse őket. Eddig három olyan fehérje ismert, amelyek szabályozzák bizonyos cirkuláris RNS-ek képződését: Quaking (QKI), Muscleblind (Mbl/MBNL1-3) és Fusedinsarcoma ( FUS ). Így a Muscleblind az éretlen transzkriptum intronjaiban lévő specifikus helyekhez kötve szabályozza saját génjének cirrNS-ének képződését. Ezen túlmenően, a cirRNS képződése olyan fehérjéktől függ, amelyek a cRNS kivágási helyein kötődnek az éretlen mRNS- hez , így elérhetetlenek a spliceoszóma számára. Összefoglalva azt mondhatjuk, hogy a cRNS biogenezis egy összetett folyamat, amelyet számos tényező kombinációja szabályoz, beleértve a fordított ismétlődések elhelyezkedését és a fehérjékkel való kölcsönhatást, amelyek közvetítik a hurkot, vagy fordítva, lehetetlenné teszik a visszaillesztést [2] .
Érdekes módon egyes archaeákban az rRNS képződése egy körkörös prekurzor molekula szakaszán keresztül megy végbe, amelyet azután egyedi rRNS-ekre vágnak [3] .
A cRNS szintézis szintje a sejttípustól függően változik . Átlagosan az aktív gének 5-20%-ánál mutatják ki a megfelelő cirkuláris RNS-eket, és egy sejt egyidejűleg 5000-25 000 cirRNS-t tartalmaz. A transzkriptomnak azonban nagyon kis részét teszik ki: ritka kivételektől eltekintve a cirRNS-ek az ugyanabból a génből szintetizált lineáris hírvivő RNS-ek mennyiségének 5-10%-át teszik ki. Egy génből általában több cirkuláris RNS izoforma íródik át, és leggyakrabban a gén második exonja szerepel a cirRNS-ben, míg az első és az utolsó exon szinte soha nem marad cirkuláris formában. Egyik vagy másik izoforma képződése szabályozható. A cirRNS szintézis szintje általában nagymértékben változik a sejtdifferenciálódás során , de általában több nap vagy akár hét is kell ahhoz, hogy jelentősen megváltozzon [2] .
A szabad végek hiányában a cirkuláris RNS-ek nem bonthatók le exonukleáz enzimekkel , amelyek a terminális nukleotidok tartós hasításával sok transzkriptumot lebontanak. Ebből a szempontból az átlagos cirkuláris RNS stabilabb, mint a lineáris mRNS: a cirRNS 19-24 óráig (néha akár 48 óráig) él, ami 2-5-ször (akár 10-szer) hosszabb, mint a lineáris molekuláké. Számos hipotézis létezik a körkörös RNS-ek lebomlásával kapcsolatban. A cirkuláris RNS-ek képesek hasítani az endonukleázokat , amelyek nem pusztítják el a nukleinsavakat a végekről, hanem töréseket vezetnek be a molekula belső részeibe. Valószínűleg ebben az esetben egy miRNS -eket tartalmazó komplex, amely az Argonaute csoport endonukleázait "indukálja" a célmolekulákba, felelős a pusztulásért. A lebontandó cirRNS-ekben egyes adenozin -maradékok specifikusan metilálhatók . Az ilyen metilált RNS-eket speciális fehérjék ismerik fel, amelyek a ribonukleinsavak lebomlási helyeire - az úgynevezett P-testekre továbbítják őket . A cirrRNS elpusztításában speciális organellumok vehetnek részt - autofagoszómák , amelyek többek között endonukleázokat tartalmaznak. A sejtek extracelluláris vezikulák részeként felesleges cirRNS-t bocsáthatnak ki a vérbe . Ha van néhány kísérleti megerősítés a körkörös RNS-ek elpusztításának első hipotetikus útjára vonatkozóan, akkor a fennmaradó modellek még kísérleti igazolásukra várnak [2] .
Mind a cirkuláris RNS-ek biológiai hatásait, mind képződésük folyamatát ismertetjük. Ezenkívül a cirkuláris RNS-ek olyan peptideket kódolhatnak, amelyek bizonyos sejtfunkciókat is ellátnak. Bár a cirRNS kialakulásához vezető visszaillesztés 100-szor ritkább, mint a hagyományos lineáris splicing, valószínű, hogy ez a két folyamat verseng egymással, és kölcsönösen elnyomják. Lehetséges, hogy a cirkuláris RNS-ek képződése során a lineáris splicing elnyomása a fő sejtfunkció ezeknek a molekuláknak. Az éretlen transzkriptum régióból való kihurkolása az intronokban lévő fordított ismétlődések komplementer kötődése miatt önmagában is hatékonyan elnyomhatja a lineáris splicinget. Ezen túlmenően, mind a backsplicing, mind a lineáris splicing ugyanazokat a régiókat igényli az átiratban; általában egy lineáris folyamatban vesznek részt, ami a legtöbb esetben elnyomja a visszaillesztést. Valójában kimutatták, hogy ugyanabból a génből származó cirkuláris RNS-ek és közönséges lineáris mRNS-ek nem szintetizálódnak egyidejűleg. A kísérleti bizonyítékok azonban azt sugallják, hogy bonyolultabb kapcsolat van a lineáris és a visszaillesztés között, mint a hagyományos kompetitív elnyomás. Lehetséges, hogy a transzkripció sebessége fontos szerepet játszhat abban, hogy az RNS-t a génből leolvassák - mRNS vagy cirkuláris. Így az alternatív splicing gyakran lasszót tartalmazó intronok (azaz a cirkuláris RNS lehetséges prekurzorai) kialakulásához vezet, és ez gyakran akkor következik be, amikor a transzkripció felgyorsul. A backsplicing és a lineáris splicing közötti választás összetettebb mechanizmusokon is alapulhat. Feltételezzük például, hogy az mbl génből kiolvasott cirkuláris RNS átveszi ennek a génnek a teljes fehérjetermékét, a Muscleblind-et. Ismeretes, hogy ez a fehérje szükséges a lineáris mbl-mRNS-ek kialakulásához, ezért a cirkuláris mbl-RNS-ek (circMbl) a hozzá kötődve és működését megakadályozva gátolják lineáris „testvéreik” szintézisét. Nem kizárt annak a lehetősége sem, hogy a cirkuláris RNS-ek komplementer módon kötődjenek az őket létrehozó gének régióihoz, azaz a DNS -hez [2] .
Számos kísérlet arra utal, hogy az EIciRNS (exon-intron) és a ciRNS (intron) befolyásolja saját génjeik transzkripcióját az RNS-polimeráz II stimulálásával . A kutatóknak sikerült kicsapniuk az EIciRNS-komplexet RNS-polimeráz II-vel antitestek segítségével , és kiderült, hogy a polimeráz stimulálásához egy másik komponensre van szükség - kis nukleáris RNS U1 . Talán az EIciRNS-sel való kölcsönhatás során az U1 úgy helyezkedik el, hogy stimulálja a polimerázt. Ugyanakkor úgy tűnik, hogy a ciRNS-ek képesek közvetlenül kötődni a kromatinhoz a "szülő" gének régiójában, és növelik transzkripciójuk sebességét. Lehetőség volt például a ci-ankrd52 nevű ciRNS-t komplexben kicsapni egy aktívan működő RNS-polimeráz II-vel (az enzim aktív formáját a C-terminális domén speciális foszforilációja különbözteti meg ). Mivel a ciRNS-ek „idegen” DNS-szekvenciákhoz is kötődhetnek, szerepük a génexpresszió szabályozásában jelentős lehet [2] .
Két (exonikus, a citoplazmában lokalizált) ecircRNS esetében kísérletileg kimutatták, hogy képesek befolyásolni a fehérjeszintézist . A circANRIL megzavarja az rRNS-t feldolgozó fehérjék komplexét , ezáltal csökkenti a funkcionális riboszómák számát és a fehérjehozamot. Ugyanakkor a circPABPN1 elnyomja a HuR fehérje munkáját , amely számos mRNS transzlációjához szükséges [2] .
A cirkuláris RNS-ek szerkezeti alapként szolgálhatnak a fehérjekomplexek összeállításához, és így fehérje-fehérje kölcsönhatásokat biztosítanak . Például a circ-Foxo3-on keresztül a ciklinfüggő kináz 2 (Cdk2) kölcsönhatásba lép inhibitorával , a p21 -gyel , ami sejtciklus leállást eredményez . Ezen túlmenően a cirkuláris RNS-ek megköthetik a fehérjéket, korlátozva mozgásukat a munkahelyekre. Így a fent említett circ-Foxo3 „zárhatja” az E2F1 transzkripciós faktort és néhány más fehérjét a citoplazmában [3] .
Egyes exonikus cirkuláris RNS-ek kötőhelyeket tartalmaznak a génexpresszió negatív szabályozóihoz, a mikroRNS-ekhez. Az angol szakirodalomban az ilyen cirkRNS-eket gyakran mikroRNS-szivacsoknak, vagy mikroRNS-eket elnyelő szivacsoknak nevezik. Hozzájuk kötődve a mikroRNS-ek többé nem tudnak kölcsönhatásba lépni a komplementer cél-mRNS-ekkel, és nem zavarják azok transzlációját. Például a CDR1as cRNS 74 miR-7 mikroRNS kötőhelyet tartalmaz, és az Sry génből leolvasott egér cRNS (amely fontos a nem meghatározásához ) 16 miR-138 kötőhelyet tartalmaz. Meg kell azonban jegyezni, hogy csak néhány cirkuláris RNS kötődik a mikroRNS-ekhez, vagyis ez inkább kivétel, mint szabály. Érdekes módon cirRNS-eket találtak egyes egysejtű eukariótákban , amelyek egyáltalán nem tartalmaznak mikroRNS-t, nevezetesen a Saccharomyces cerevisiae élesztőgombában és a Plasmodium falciparum maláriás plazmodiumban . Így a mikroRNS-ekhez való kötődés nem lehet a cirkuláris RNS-ek fő funkciója [2] .
Számos cirkuláris RNS játszik fontos szerepet a vírusellenes immunitásban . Például azok a csirkék , amelyek rezisztensek a madárleukémia vírusára , 12 cirkRNS-t termelnek nagyobb mennyiségben, mint a normál csirkék. Ezen molekulák közül sok olyan mikroRNS-ekhez kötődik, amelyek szabályozzák az olyan gének expresszióját, amelyek olyan immunfolyamatokhoz kapcsolódnak, mint a B-limfocita aktiváció és az antigénprezentáció . Érdekes módon az immunrendszer is befolyásolja a cirkuláris RNS-ek szintézisét. Például az NF90 és NF110 immunfaktorok (az ILF3 gén splice variánsai ) serkentik a cirRNS képződését egy érlelő transzkriptumból a sejtmagban. Vírusfertőzés esetén ezek a fehérjék a citoplazmába kerülnek, ahol a vírus mRNS-éhez kötődnek, és gátolják a vírus életciklusát ; a nukleáris cirRNS mennyisége csökken, ami modulálhatja a génexpressziót. A CircRNS-ek a fertőzés visszaszorításában is részt vehetnek azáltal, hogy vírusos vagy sejtes miRNS-ekhez kötődnek, amelyek befolyásolják az immunválaszt [3] .
Ismeretes, hogy a legtöbb backsplicing esemény exonokat foglal magában, és a fehérjét kódoló gének RNS-ében történik. A legtöbb mRNS transzlációja azzal kezdődik, hogy a riboszóma felismeri az mRNS 5' végén lévő módosított nukleotidot, az úgynevezett cap -t . A CircRNS-eknek nincs szabad 5'-végük, így nem lehet sapkájuk. Azonban néhány sejtes és vírus RNS lefordítható sapka hiányában egy speciális szekvencia - IRES - részvételével . Ugyanez történhet a cirkuláris RNS-ekkel [2] [3] .
Valójában az IRES-t tartalmazó és valamilyen peptidet kódoló mesterséges cirkRNS-ek lefordíthatók. Kimutatták azonban, hogy az élő sejtekben lévő cirkuláris RNS-ek többsége nem kapcsolódik riboszómákhoz, így nem valószínű, hogy transzlációjuk széles körben elterjedt. Eddig két cirkuláris RNS ismeretes, amelyek valószínűleg in vivo fehérjéket szintetizálnak , ezek a circMbl és a circZNF609. Érdemes megjegyezni, hogy ezek a molekulák némileg nem szabványosak: az első esetben a backsplicing az első exont érinti, amely, mint emlékszünk, általában nem szerepel a körkörös RNS-ekben, a második esetben pedig az 5' fragmens. -az eredeti transzkriptum nem lefordított régiója belép a cirRNS-be, amely IRES tulajdonságokkal rendelkezik. Lehetséges, hogy a cirRNS-sel történő fehérjeszintézis csak speciális körülmények között, például stressz - hősokk vagy éhezés [2]] esetén lehetséges .
Ha feltételezzük, hogy egy körkörös RNS egy nyitott leolvasási keretet tartalmaz három többszörösének megfelelő számú nukleotiddal, akkor elméletileg az ilyen RNS transzlációja a gördülő gyűrűs mechanizmus szerint mehet végbe . Egy ilyen transzláció eredménye elméletileg ismétlődő aminosavblokkok végtelen lánca lenne, és növekedését korlátozná a riboszómák folyamatképessége . A celluláris cRNS-ek esetében még nem ismertek hasonló esetek, de valami hasonló előfordul a rizssárgafolt-vírushoz kapcsolódó viroid cRNS -sel [2] .
A cRNS kimutatás terén elért közelmúltbeli fejlemények az RNS-szekvenálási technológia fejlesztéseinek köszönhetők , mint például az egyszeri leolvasások hosszának növelése az RNS és az ismert génekhez illesztési algoritmusok fejlesztése , valamint az RNS - könyvtárak bővítése A cirkuláris RNS-ek megkülönböztethetők a lineáris RNS- ektől bioinformatikai megközelítéssel (szekvenálási eredmények alapján), vagy exonukleázokat használó „nedves” módszerrel. Mint fentebb említettük, ezek az enzimek gyorsan hasítják a lineáris RNS-eket, de a cirkuláris RNS-eket érintetlenül hagyják. Több ezer cirkuláris RNS-t azonosítottak exonukleázok segítségével, de a legtöbb cirkRNS- t speciális algoritmusokat alkalmazó nagy áteresztőképességű szekvenálásnak köszönhetően írták le [4] .
Jelenleg számos adatbázis létezik a körkörös RNS-ekre és online eszközök a velük való munkavégzésre. Köztük [5] :
A cirkuláris RNS-ek különböző mennyiségben találhatók meg a vérplazmában, és a perifériás vérben még több, mint a szervsejtekben . Ennek okai nem tisztázottak, különös tekintettel arra, hogy a 25%-os szérumban a cirRNS-ek már 30 másodperc után lebomlanak (átlagosan cirkuláris RNS 1-2 napig létezik a sejtben). Bárhogy is legyen, bizonyos cirkuláris RNS-ek jelenléte és mennyisége a vérplazmában a szervezet egészségének fontos mutatójaként szolgálhat. Más szavakkal, a cRNS-ek biomarkerként használhatók olyan patológiák diagnosztizálására és stádiumba állítására , mint a szívkoszorúér-betegség , a különböző típusú rák (beleértve a leukémiát ), a cukorbetegség és a sclerosis multiplex [2] .
Néhány cirkuláris RNS a sejt öregedéséhez kapcsolódik . Így a circPVT1 gátolja a proliferáló fibroblasztok öregedését [4] . Számos cirkuláris RNS összefüggésbe hozható az életkorral összefüggő változásokkal a szervezetben: például azonosítottak olyan molekulákat, amelyek a majmok izomöregedéséhez kapcsolódnak [6] .
Eddig 10 cirkuláris RNS-ről ismert, hogy részt vesz a szív- és érrendszeri és anyagcsere-betegségek (például diabetes mellitus) kialakulásában. A már említett circANRIL az rRNS érésének gátlásával és ezáltal a sejtosztódás gátlásával védekezhet az érelmeszesedés ellen, melynek túlzott proliferációja atheroscleroticus plakkok kialakulásához vezet . A MICRA nevű cirkuláris RNS jelezheti a szívizominfarktus miatti bal kamrai diszfunkciót . A szív hipertrófiájával és szívelégtelenségével számos cirkuláris RNS szintézisének csökkenése figyelhető meg [2] .
Kimutatták, hogy egyes sejtes RNS-ek összefüggésben állnak a diabetes mellitusszal. Ismeretes, hogy a hasnyálmirigy β-sejtjeiben a miR-7 mikroRNS túltermelése hozzájárul a cukorbetegség kialakulásához, míg a ciRS-7, a miR-7-et megkötő cirkuláris RNS túltermelése ezekben a sejtekben éppen ellenkezőleg, javítja az inzulinszekréciót . 4] .
Különféle élőlények idegszöveteiben (a gyümölcslegyektől az emberekig ) különösen sok cirkuláris RNS található. Talán ez annak köszönhető, hogy az idegsejtekben nagyobb az alternatív splicing előfordulása . Ezenkívül a bennük lévő körkörös RNS-ek speciális funkciókat látnak el az idegimpulzusok vezetésével kapcsolatban . A Qki fehérje , amely részt vesz a cirrNS képződésében, részt vesz az oligodendrociták fejlődésében és szabályozza a mielinizációt , valamint gátolja a dendritek képződését a központi idegrendszerben . A fehérje génjének mutációi ataxiával és skizofréniával járnak [2] . Bizonyíték van a cirkuláris RNS-ek és az Alzheimer-kór közötti összefüggésre is [4] [6] .
Több mint 20 cRNS-t hoznak összefüggésbe különféle rákos megbetegedések, például a vastagbél- , petefészek- , hólyag- , emlő- , máj- , gyomor- , vese- és prosztatarák kialakulásával . Az onkológiai folyamatokat gyakran transzlokációk kísérik , amelyek tumorspecifikus cirRNS fajok megjelenéséhez vezetnek. Leggyakrabban a rákkal kapcsolatos cRNS-ek szivacsként funkcionálnak a miRNS-ek számára [2] .