Avidin

Az avidin egy tetramer biotinkötő fehérje , amely madarak , hüllők és kétéltűek petevezetékében termelődik , és a tojások fehérjében rakódik le . Az avidin család dimer tagjai is megtalálhatók egyes baktériumokban [1] . A csirke tojás fehérjéjében az avidin a teljes fehérje körülbelül 0,05%-át teszi ki (körülbelül 1800 g). mcg tojásonként). A tetramer fehérje négy azonos alegységet (homotetramert) tartalmaz, amelyek mindegyike nagy affinitással és specifitással képes kötődni a biotinhoz (B 7 vitamin, H vitamin). Az avidin-biotin komplex mért disszociációs állandója K D ≈ 10 -15 M, ami az egyik legerősebb ismert nem kovalens kötéssé teszi [2] .

Az avidin tetramer formájának méretét 66-69 kDa -ra becsülik [3] . A molekulatömeg 10%-a szénhidrát, amely négy-öt mannóz- és három N-acetil-glükózamin- maradékból áll [4] . Az avidin szénhidrát fragmensei legalább három egyedi szerkezeti típusú oligoszacharidot tartalmaznak , amelyek szerkezetükben és összetételükben hasonlóak [5] .

Funkcionális avidin csak a nyers tojásban található, mivel a fehérje biotin-affinitása a főzés során megsemmisül. Az avidin természetes funkciója a tojásban nem ismert, bár feltételezik, hogy a petevezetékben baktériumnövekedés-gátlóként termelődik a biotinhoz való kötődés révén, amely jótékony hatással van a baktériumok növekedésére. Ennek bizonyítéka a sztreptavidin, egy rokon fehérje, amely ugyanolyan affinitással rendelkezik a biotinhoz és nagyon hasonló kötőhellyel rendelkezik, amelyet a Streptomyces baktériumok egyes törzsei termelnek, és amelyről úgy gondolják, hogy antibiotikumként gátolja a versengő baktériumok növekedését [6] .

Az avidin nem glikozilált formáját izolálták egy kereskedelemben kapható termékből ; azonban nem világos, hogy a nem glikozilezett forma a természetben fordul elő, vagy gyártási folyamat terméke [7] .

Felfedezés

Az avidint Esmond Emerson Snell (1914–2003) fedezte fel . Ez a felfedezés azzal a megfigyeléssel kezdődött, hogy a nyers tojásfehérje diétán lévő csirkék biotinhiányban szenvednek annak ellenére, hogy az étrendjükben van a vitamin [8] . Arra a következtetésre jutottak, hogy a tojásfehérje komponens megkötötte a biotint [ 8] , amit Snell in vitro élesztővizsgálattal igazolt [9] . Snell később izolálta a tojásfehérje biotin megkötéséért felelős komponensét, és Paul Györggyel együttműködve megerősítette, hogy az izolált tojásfehérje okozta a biotinhiányt vagy a "tojásfehérje-károsodást". Abban az időben a Texasi Egyetem kutatói ezt a fehérjét feltételesen avidalbuminnak (szó szerint "éhes albuminnak") nevezték el [9] . A fehérje nevét később "avidin"-re változtatták a biotin iránti affinitása miatt (avidin + biotin) [10] .

Alkalmazások

Az 1970-es években végzett kutatások hozzájárultak ahhoz, hogy az avidin-biotin rendszert a biológiai tudományok hatékony eszközévé tegyék. Ismerve az avidin-biotin komplex erősségét és specifitását, a kutatók számos kutatási projektben elkezdték csirke avidint és streptavidint szondaként és affinitásmátrixként használni [11] [12] [13] [14] . Nem sokkal ezután Bayer és Wilczek kutatók új módszereket és reagenseket fejlesztettek ki az antitestek és más biomolekulák biotinilezésére [15] [16] , amelyek lehetővé tették az avidin-biotin rendszer számos biotechnológiai alkalmazásban való alkalmazását. Manapság az avidint a kutatástól és a diagnosztikától az orvosi eszközökig és a gyógyszerekig számos alkalmazási területen használják.

Az avidin biotinnal szembeni affinitását számos biokémiai vizsgálatban használják, beleértve a Western-blot- , ELISA- , ELISPOT- és top- down teszteket. Egyes esetekben a biotinilezett antitestek alkalmazása lehetővé tette a radiojóddal jelölt antitestek helyettesítését a radioimmunoassay rendszerekben egy nem radioaktív vizsgálati rendszer létrehozása érdekében. 

A szilárd hordozóra rögzített avidint tisztító közegként is használják a biotinnal jelölt fehérje vagy nukleinsav molekulák befogására. Például a sejtfelszíni fehérjék specifikusan megjelölhetők egy membránt át nem eresztő biotin reagenssel, majd specifikusan befoghatók egy avidin alapú hordozó segítségével. 

Módosított űrlapok

A fő töltésű glikoproteinként az avidin bizonyos alkalmazásokban nem specifikus kötődést mutat. A neutravidin , egy deglikozilált argininnel módosított avidin, semlegesebb izoelektromos ponttal (pI) rendelkezik, és a natív avidin alternatívájaként elérhető, ha nem specifikus kötődési problémák merülnek fel. A csirke avidin deglikozilált semleges formái a Sigma-Aldrich (Extravidin), a Thermo Scientific (NeutrAvidin), az Invitrogen (NeutrAvidin) és az e-Proteins (NeutraLite) kínálatában állnak rendelkezésre.

Az avidin-biotin kötés erőssége miatt az avidin-biotin komplex disszociációja extrém körülményeket igényel, amelyek fehérje denaturációt okoznak. Az avidin-biotin komplex irreverzibilis természete korlátozhatja az avidin alkalmazását az affinitáskromatográfiában, ahol a befogott ligandum felszabadítása kívánatos. A kutatók reverzibilis kötési jellemzőkkel rendelkező avidint hoztak létre a tirozin nitrálásával vagy jódozásával a kötőhelyen [17] . A módosított avidin erős biotinkötési jellemzőket mutat pH 4-nél, és biotint bocsát ki 10 vagy magasabb pH-értéken [17] . A biotinnal szemben csökkent affinitással rendelkező avidin monomer formáját számos kereskedelmi forgalomban kapható affinitásgyanta is alkalmazza. A monomer avidint úgy állítják elő, hogy az immobilizált natív avidint karbamiddal vagy guanidin-HCl-dal (6-8 M) kezelik, így alacsonyabb disszociációt kap, K D ≈ 10 -7 M [18] . Ez lehetővé teszi az avidin mátrix enyhébb, nem denaturáló körülmények között történő eluálását alacsony biotinkoncentráció vagy alacsony pH-körülmények mellett. Egyetlen nagy affinitású biotinkötő helyhez, keresztkötés nélkül, az avidin távoli rokonának, a sztreptavidinnek egy monovalens változata használható [19] .

A biotinkötés blokkolása

Az avidin termikus stabilitása és biotinkötő aktivitása gyakorlati és elméleti szempontból egyaránt érdekes a kutatók számára, mivel az avidin stabilitása szokatlanul magas, és az avidin antinutriens az emberi táplálékban [20] . A Biochemical and Biophysical Research Communications folyóiratban 1966-ban megjelent tanulmány kimutatta, hogy az avidin szerkezete stabil maradt 70 °C (158 °F) °C alatti hőmérsékleten. . 70 °C (158 °F) felett az avidin szerkezete gyorsan lebomlik, és 85 °C -on (185 °F) jelentős szerkezetvesztés és biotinmegkötő képesség elvesztése következik be [21] . A Journal of Food Science 1991-es elemzése jelentős avidin aktivitást talált főtt tojásfehérjében: "Az átlagos maradék avidin aktivitás sült, főtt és főtt (2 perc) tojásfehérjében 33%, 71% és 40% volt nyersben. Az elemzés azt mutatta, hogy a főzési idő nem volt elegendő a tojásfehérje összes hideg pontjának megfelelő felmelegítéséhez. Az avidin biotinkötő képességének teljes inaktiválásához 4 percnél hosszabb forralás szükséges [22] .

Egy 1992-es tanulmány kimutatta, hogy az avidin biotinkötő aktivitásának termikus inaktiválását a D 121 írta le .  °C = 25 perc és z = 33 °C. Ez a tanulmány ellentmondott azoknak a korábbi felvetéseknek, amelyek szerint az avidin kötőhely hődenaturáció hatására elpusztul [ 20] .

Az avidin biotinkötő tulajdonságait használták az idrabiotaparinux kifejlesztésében , amely egy hosszú hatású, kis molekulatömegű heparin , amelyet vénás trombózis kezelésére használnak . Az idraparinux elhúzódó hatása miatt aggodalmak merültek fel a vérzéses szövődmények klinikai kezelésével kapcsolatban. Ha egy biotinfragmenst adunk az idraparinux molekulához, idrabiotaparinux képződik; véralvadásgátló hatása vérzéses körülmények között intravénás avidin infúzióval megszüntethető [23] .

Lásd még

• Streptavidin
• Biotiilezés

Hivatkozások

1. ↑ Satu H. Helppolainen, Kirsi P. Nurminen, Juha A.E. Määttä, Katrin K. Halling, J. Peter Slotte. Rhizavidin a Rhizobium etli-ből: az első természetes dimer az avidin fehérjecsaládban  // The Biochemical Journal. - 2007-08-01. - T. 405 , sz. 3 . – S. 397–405 . — ISSN 1470-8728 . - doi : 10.1042/BJ20070076 .
2. ↑ NM zöld. AVIDIN. 1. A (14-C)BIOTIN HASZNÁLATA KINETIKAI TANULMÁNYOKHOZ ÉS VIZSGÁLATHOZ  // The Biochemical Journal. — 1963-12. - T. 89 . – S. 585–591 . — ISSN 0264-6021 . - doi : 10.1042/bj0890585 .
3. ↑ J. Korpela. Az avidin, egy nagy affinitású biotinkötő fehérje, mint a biológiai kutatások eszköze és tárgya  // Orvosbiológia. - 1984. - T. 62 , sz. 1 . – S. 5–26 . — ISSN 0302-2137 .
4. ↑ NM zöld. Avidin  // Fejlődés a fehérjekémiában. - 1975. - T. 29 . – S. 85–133 . — ISSN 0065-3233 . - doi : 10.1016/s0065-3233(08)60411-8 .
5. ↑ R. C. Bruch, H. B. White. Az avidin glikopeptidek összetételi és szerkezeti heterogenitása  // Biokémia. — 1982-10-12. - T. 21 , sz. 21 . — S. 5334–5341 . — ISSN 0006-2960 . - doi : 10.1021/bi00264a033 .
6. ↑ W. A. ​​Hendrickson, A. Pähler, J. L. Smith, Y. Satow, E. A. Merritt. A sztreptavidin magjának kristályszerkezete a szinkrotron sugárzás többhullámú anomális diffrakciójából meghatározva  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 1989-04. - T. 86 , sz. 7 . – S. 2190–2194 . — ISSN 0027-8424 . - doi : 10.1073/pnas.86.7.2190 .
7. ↑ Y. Hiller, J. M. Gershoni, E. A. Bayer, M. Wilchek. A biotin kötődik az avidinhez. Az oligoszacharid oldallánc nem szükséges a ligand asszociációhoz  // The Biochemical Journal. — 1987-11-15. - T. 248 , sz. 1 . – S. 167–171 . — ISSN 0264-6021 . - doi : 10.1042/bj2480167 .
8. ↑ 1 2 R. E. Eakin, W. A. ​​McKinley, R. J. Williams. A TOJÁSFEHÉR SÉRÜLÉS CSIRBÉBEN ÉS KAPCSOLATA A H-VITAMIN (BIOTIN) HIÁNYÁHOZ  // Science (New York, NY). — 1940-09-06. - T. 92 , sz. 2384 . – S. 224–225 . — ISSN 0036-8075 . - doi : 10.1126/tudomány.92.2384.224 .
9. ↑ 1 2 Esmond E. Snell, Robert E. Eakin, Roger J. Williams. A biotin kvantitatív tesztje és az előfordulásával és tulajdonságaival kapcsolatos megfigyelések  //  Journal of the American Chemical Society. - 1940-01. — Vol. 62 , iss. 1 . — P. 175–178 . — ISSN 1520-5126 0002-7863, 1520-5126 . - doi : 10.1021/ja01858a052 .
10. ↑ Nicole Kresge, Robert D. Simoni, Robert L. Hill. Az Avidin felfedezése, Esmond E. Snell  //  Journal of Biological Chemistry. — 2004-10. — Vol. 279 , iss. 41 . — P. e5–e6 . - doi : 10.1016/S0021-9258(20)77095-X .
11. ↑ K. Hofmann, Y. Kiso. A peptidek és fehérjék szilárd hordozókhoz való célzott rögzítésének megközelítése  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 1976–10. - T. 73 , sz. 10 . — S. 3516–3518 . — ISSN 0027-8424 . - doi : 10.1073/pnas.73.10.3516 .
12. ↑ E. Bayer, E. Skutelsky, D. Wynne, M. Wilchek. Ferritin-avidin konjugátumok előállítása reduktív alkilezéssel elektronmikroszkópos citokémiában  // The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. – 1976-08. - T. 24 , sz. 8 . – S. 933–939 . — ISSN 0022-1554 . - doi : 10.1177/24.8.182877 .
13. ↑ L. Angerer, N. Davidson, W. Murphy, D. Lynch, G. Attardi. Elektronmikroszkópos vizsgálat a 4S és riboszomális RNS gének relatív helyzetéről a HeLa sejtek mitokondriális DNS-ében  // Cell. — 1976-09. - T. 9 , sz. 1 . – S. 81–90 . — ISSN 0092-8674 . - doi : 10.1016/0092-8674(76)90054-4 .
14. ↑ MH Heggeness, JF Ash. Az avidin-biotin komplex alkalmazása az aktin és a miozin lokalizálására fluoreszcens mikroszkóppal  // The Journal of Cell Biology. – 1977-06. - T. 73 , sz. 3 . – S. 783–788 . — ISSN 0021-9525 . doi : 10.1083 / jcb.73.3.783 .
15. ↑ EA Bayer, MG Zalis, M. Wilchek. 3-(N-Maleimido-propionil)biocitin: sokoldalú, tiol-specifikus biotinilező reagens  // Analytical Biochemistry. - 1985-09. - T. 149 , sz. 2 . – S. 529–536 . — ISSN 0003-2697 . - doi : 10.1016/0003-2697(85)90609-8 .
16. ↑ M. Wilchek, H. Ben-Hur, EA Bayer. p-Diazobenzoil biocitin – új biotinilező reagens tirozinok és hisztidinek jelölésére fehérjékben  // Biokémiai és biofizikai kutatási közlemények. - 1986-07-31. - T. 138 , sz. 2 . – S. 872–879 . — ISSN 0006-291X . - doi : 10.1016/s0006-291x(86)80577-0 .
17. ↑ 1 2 E. Morag, E. A. Bayer, M. Wilchek. A biotinkötés reverzibilitása a tirozin szelektív módosításával az avidinben  // The Biochemical Journal. — 1996-05-15. - T. 316 (Pt 1) . – S. 193–199 . — ISSN 0264-6021 . - doi : 10.1042/bj3160193 .
18. ↑ R.A. Kohanski, M.D. Lane. Egyértékű avidin affinitás oszlopok  // Methods in Enzymology. - 1990. - T. 184 . — S. 194–200 . — ISSN 0076-6879 . - doi : 10.1016/0076-6879(90)84274-k .
19. ↑ Mark Howarth, Daniel J.-F. Chinnapen, Kimberly Garrow, Pieter C. Dorrestein, Melanie R. Grandy. Egy monovalens sztreptavidin egyetlen femtomoláris biotinkötő hellyel  // Nature Methods. — 2006-04. - T. 3 , sz. 4 . – S. 267–273 . — ISSN 1548-7091 . - doi : 10.1038/nmeth861 .
20. ↑ T.D. 12 _ Durance, N. S. Wong. Az avidin termikus inaktiválásának kinetikája  //  Food Research International. – 1992-01. — Vol. 25 , iss. 2 . — P. 89–92 . - doi : 10.1016/0963-9969(92)90148-X .
21. ↑ Alan B. Pritchard, Donald B. McCormick, Lemuel D. Wright. Az avidin és az avidin-biotin komplex hődenaturációjának optikai rotációs diszperziós vizsgálata  //  Biochemical and Biophysical Research Communications. — 1966-12. — Vol. 25 , iss. 5 . — P. 524–528 . - doi : 10.1016/0006-291X(66)90623-1 .
22. ↑ TD Durance. A főtt tojásfehérje aktivitásának maradéka, fokozott érzékenységgel vizsgálva  //  Journal of Food Science. — 1991-05. — Vol. 56 , iss. 3 . — P. 707–709 . - ISSN 1750-3841 0022-1147, 1750-3841 . - doi : 10.1111/j.1365-2621.1991.tb05361.x .
23. ↑ Harry R. Buller, Alex S. Gallus, Gerard Pillion, Martin H. Prins, Gary E. Raskob. Enoxaparin, majd hetente egyszeri idrabiotaparinux versus enoxaparin plusz warfarin akut tüneti tüdőembóliában szenvedő betegeknél: randomizált, kettős vak, kettős hatóanyagú, nem inferiority vizsgálat  // Lancet (London, Anglia). — 2012-01-14. - T. 379 , sz. 9811 . – S. 123–129 . — ISSN 1474-547X . - doi : 10.1016/S0140-6736(11)61505-5 .

Linkek

• A tojás egy nagyon előnyös interakciós  cikk a Protein Data Bankban