A Streptavidin / ˌstrɛpˈtævɪdɪn / egy 66,0 kDa ( tetramer ) fehérje , amelyet a Streptomyces avidinii baktériumból tisztítanak . _ _ _ _ A sztreptavidin homotetramerek rendkívül nagy affinitással rendelkeznek a biotinhoz (más néven B7-vitamin vagy H-vitamin). ≈10 -14 mol/l nagyságrendű disszociációs állandóval (K d ) [1]a biotin sztreptavidinhez való kötődése a természetben ismert egyik legerősebb nem kovalens kölcsönhatás. A sztreptavidint széles körben használják a molekuláris biológiában és a bionanotechnológiában, mivel a sztreptavidin-biotin komplex ellenáll a szerves oldószereknek, denaturálószereknek (pl. guanidinium-klorid ), detergenseknek (például SDS , Triton X-100 ), proteolitikus enzimeknek, valamint szélsőséges hőmérsékleti és pH-értékeknek.
A biotinhoz kötött sztreptavidin kristályszerkezetét két csoport írta le 1989-ben. A szerkezetet Hendrickson és munkatársai többhullámú anomális diffrakcióval oldották meg. [2] a Columbia Egyetemen , és többszörös izomorf szubsztitúciót alkalmazva Weber et al. [3] az EI DuPont Központi Kutatás és Fejlesztés területén. 2017 szeptemberéig 171 szerkezetet helyeztek el a Protein Data Bankban . A teljes listáért lásd ezt a linket . A teljes hosszúságú 159-es aminosavból álló fehérje N- és C-terminálisát rövidebb "mag" sztreptavidinné alakítják, amely jellemzően a 13-139. aminosavakból áll; az N- és C-terminális eltávolítása szükséges a biotinnal szembeni legmagasabb kötési affinitás eléréséhez. A sztreptavidin monomer másodlagos szerkezete nyolc antiparallel β-szálból áll, amelyek összehajtogatva egy antiparallel β-hordó harmadlagos szerkezetet alkotnak. A biotinkötő hely minden β-hordó egyik végén található. Négy azonos sztreptavidin monomer (azaz négy azonos β-szár) kötődik a sztreptavidin tetramer kvaterner szerkezetéhez. A biotinkötő hely minden szárban a szár belsejéből származó maradékokból, valamint a szomszédos alegységből származó konzervált Trp120-ból áll. Így minden alegység hozzájárul a szomszédos alegység kötőhelyéhez, ezért a tetramer a funkcionális dimerek dimerjének is tekinthető.
A sztreptavidin-biotin komplex számos kristályszerkezete rávilágított ennek a figyelemre méltó affinitásnak az eredetére. Először is, a kötőzseb és a biotin között nagy alaki komplementaritás van. Másodszor, a kötőhelyen a biotinnal hidrogénkötések kiterjedt hálózata képződik. Nyolc hidrogénkötés van közvetlenül a kötőhelyen (a hidrogénkötések úgynevezett "első héja") lévő maradékokhoz, beleértve az Asn23, Tyr43, Ser27, Ser45, Asn49, Ser88, Thr90 és Asp128 maradékokat. Van egy "második héj" is a hidrogénkötéseknek, beleértve azokat a maradékokat is, amelyek kölcsönhatásba lépnek az első héjmaradékokkal. A sztreptavidin biotinnal szembeni affinitása azonban meghaladja azt a mértéket, amely önmagában a hidrogénkötések kölcsönhatásaiból várható lenne, ami egy másik mechanizmusra utal, amely hozzájárul a magas affinitáshoz [4] . A biotinkötő zseb hidrofób , és számos van der Waals által közvetített érintkezés és hidrofób kölcsönhatás van a biotinnal, amikor a zsebben van, amiről úgy gondolják, hogy megmagyarázza a nagy affinitást. Különösen a zseb tartósított triptofánmaradványokkal van bélelve. Végül a biotinkötést a 3-as és 4-es β-szálakat (L3/4) összekötő flexibilis hurok stabilizálása kíséri, amely a megkötött biotin fölé záródik, „fedélként” működik a kötőzseb felett, és lehetővé teszi a biotin rendkívül lassú felszabadulását. biotin. disszociációs ráta.
A sztreptavidin mutációjára tett kísérletek többsége a biotinkötési affinitás csökkenését eredményezi, ami egy ilyen optimalizált rendszerben várható. Azonban egy újonnan létrehozott streptavidin mutánsról, a traptavidinről kiderült, hogy a biotin több mint tízszer lassabban disszociál, emellett nagyobb termikus és mechanikai stabilitása is van [5] . A disszociációs ráta csökkenése az asszociációs ráta kétszeres csökkenésével járt.
A biotinkötési affinitás megszakítható a sztreptavidin kémiai jelölésével, például amino-reaktív fluoroforokkal ; A flavidin egy lizin oldalláncok nélküli streptavidin mutáns, amely megőrzi jó biotinkötési jellemzőit, miután fluoreszcens festékkel jelölték, amikor a festék az amino-terminálishoz kapcsolódik [6] .
A sztreptavidin leggyakoribb felhasználási területei közé tartozik a különböző biomolekulák tisztítása vagy kimutatása. A sztreptavidin és a biotin erős kölcsönhatása felhasználható különböző biomolekulák egymáshoz vagy szilárd hordozóhoz való rögzítésére. Szigorú feltételek szükségesek a sztreptavidin-biotin kölcsönhatás megszakításához, amely gyakran denaturálja a tisztítandó fehérjét. Kimutatták azonban, hogy egy rövid, 70 °C feletti vízben történő inkubálás reverzibilisen megszakítja a kölcsönhatást (legalábbis a biotinilált DNS esetében) a sztreptavidin denaturációja nélkül, ami lehetővé teszi a sztreptavidin szilárd hordozó újrafelhasználását [7] . A streptavidin másik alkalmazása a Strep-tag peptiddel genetikailag módosított fehérjék tisztítása és kimutatása . A sztreptavidint széles körben használják Western blottolásban és immunoassay-ben, egyes riportermolekulákkal, például torma-peroxidázzal konjugálva . A sztreptavidint a nanobiotechnológia feltörekvő területén is használták , biológiai molekulákat, például fehérjéket vagy lipideket használva nanoméretű eszközök/szerkezetek létrehozására. Ebben az összefüggésben a sztreptavidin építőelemként használható biotinilált DNS-molekulák megkötéséhez, hogy egyfalú szén nanocsövekből [8] vagy akár összetett DNS-poliéderekből [9] állványokat hozzanak létre . A tetramer sztreptavidint olyan központként is használták, amely köré más fehérjéket is el lehet helyezni egy affinitáscímkével, mint például a Strep-tag vagy az AviTag , vagy a SpyTag-gel való genetikai fúzióval [10] . A SpyTag-gel való fúzió lehetővé tette 8 vagy 20 sztreptavidin alegységből álló szerelvények létrehozását. Az atomerőmikroszkópos vizsgálatokhoz használt molekuláris erőpróbával [ 11] mellett új anyagokat is hoztak létre, például háromdimenziós kristályrácsokat [12] . A sztreptavidin gyengén savas izoelektromos pontja (pI) ~5, de a kereskedelemben kapható a sztreptavidin rekombináns formája is, amelynek csaknem semleges pI értéke.
Előre célzott immunterápiaAz előre célzott immunterápia a rákspecifikus antigének elleni monoklonális antitesthez konjugált sztreptavidint, majd radioaktívan jelölt biotin injekciót alkalmaz, hogy csak a rákos sejtbe juttasson sugárzást. A kezdeti akadályok közé tartozik a sztreptavidin biotinkötő helyek endogén biotinnal való telítése a beadott radioaktívan jelölt biotin helyett, valamint a vesék nagyfokú radioaktív expozíciója a sztreptavidin erős adszorpciós tulajdonságai miatt a sejteken. Az adherens sejttípusokhoz, például aktivált vérlemezkékhez és melanómákhoz való magas szintű kötődésről ma úgy gondolják, hogy a sztreptavidin RYD szekvenciája által közvetített integrin kötődés eredménye [13] .
A sztreptavidin egy tetramer, és mindegyik alegység azonos affinitással köti a biotint. A multivalencia előnyt jelent az olyan alkalmazásokban, mint például az MHC tetramer festés , ahol az aviditási hatások javítják a sztreptavidinhez kapcsolódó MHC-molekulák azon képességét, hogy specifikus T-sejteket detektáljanak [14] . Más esetekben, például a sztreptavidin használata specifikus fehérjék sejten való megjelenítésére, a polivalencia ronthatja a kérdéses fehérje működését. A monovalens sztreptavidin a streptavidin mesterségesen előállított rekombináns formája, amely tetramer, de a négy kötőhely közül csak az egyik működik. Ennek az egyetlen kötőhelynek az affinitása 10-14 mol/l, és nem okozhat keresztkötéseket [15] . A monovalens sztreptavidin alkalmazásai közé tartozik a sejtfelszíni receptorok fluoreszcencia követése , a DNS origami díszítése , valamint a krioelektronmikroszkópiás területek azonosítására szolgáló mutató .
A monomer streptavidin a sztreptavidin rekombináns formája, amely olyan mutációkkal rendelkezik, amelyek a tetramert monomerré hasítják, és növelik a kapott izolált alegység oldhatóságát. A sztreptavidin monomer változatainak biotinnal szembeni affinitása 10 -7 mol/l 10 -8 mol/l, ezért nem ideálisak jelölésre, de hasznosak tisztításhoz, ahol reverzibilitás kívánatos [16] [17] .
Két vegyértékűTetramerenként pontosan két biotinkötő hellyel rendelkező sztreptavidint úgy állíthatunk elő, hogy összekeverjük az alegységeket funkcionális biotinkötő hellyel és anélkül, és ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk . A funkcionális kötőhelyek itt ugyanolyan biotinkötési stabilitást mutatnak, mint a vad típusú streptavidin. A két biotinkötő hellyel együtt (cisz-bivalens) vagy külön (transz-bivalens) rendelkező, kétértékű sztreptavidin külön is tisztítható [18] .
HáromértékűTetramerenként pontosan három biotinkötő hellyel rendelkező sztreptavidint is elő lehet állítani ugyanazzal az elvvel, mint a kétértékű sztreptavidinek esetében [19] .
Magas vegyértékű sztreptavidinekMagasabb vegyértékű sztreptavidinokat állítottak elő izopeptid kötés konjugációs kémiával SpyTag /SpyCatcher technológiával [20] . Ez egy sztreptavidin-tetramerre utal, három biotinkötő hellyel és az elhalt sztreptavidinnel, amely a SpyTag-hez vagy a SpyCatcher-hez van fuzionálva. Ha különböző tetramereket keverünk össze, kovalens kötés képződik, több biotinkötő helyet biztosítva. Ezzel a módszerrel molekulánként hat és tizenkét biotinkötő helyet hoztak létre.
A sztreptavidin nem az egyetlen fehérje, amely nagy affinitással képes megkötni a biotint. Az avidin a másik legismertebb biotinkötő fehérje. Az eredetileg tojássárgájából izolált avidin szekvenciaazonossága csak 30%-ban van a sztreptavidinnel, de szinte azonos másodlagos, harmadlagos és kvaterner szerkezettel. Az avidinnek nagyobb affinitása a biotinhoz ( Kd ~ 10-15 M ), de a sztreptavidinnel ellentétben az avidin glikozilált, pozitív töltésű, és pszeudokatalitikus aktivitással rendelkezik (az avidin fokozhatja a biotin és a nitrofenil közötti észterkötés lúgos hidrolízisét). csoport) és nagyobb az aggregációs hajlam. Másrészt a sztreptavidin a legjobb kötőanyag a biotin-konjugátumhoz; Az avidin kötési affinitása kisebb, mint a sztreptavidin, ha a biotint egy másik molekulához konjugálják, annak ellenére, hogy az avidin nagyobb affinitást mutat a szabad, nem konjugált biotinhoz. Mivel a sztreptavidinnek nincs szénhidrát -módosítása, és szinte semleges pI -je van, előnye, hogy sokkal kisebb a nem specifikus kötődése , mint az avidin. A deglikozilált avidin (NeutrAvidin) jobban összehasonlítható méretben, pI-ben és a sztreptavidinhez való nem specifikus kötődésében.
Streptavidin vagy avidin család fehérjéit kutató és fejlesztő csoportok (ábécé sorrendben)