A Western-blot (western-blot, protein immunoblot, angol Western-blot ) egy analitikai módszer, amelyet a mintában lévő specifikus fehérjék meghatározására használnak . Az első lépésben fehérjeelektroforézist alkalmaznak poliakrilamid gélben a denaturált polipeptidek hossz (általában SDS jelenlétében ) vagy a fehérje háromdimenziós szerkezete (natív állapotban) elválasztására. Ezután a fehérjéket nitrocellulóz- vagy PVDF -membránra visszük át, majd egy adott fehérjére specifikus antitestek segítségével detektáljuk [1] [2] .
Számos kereskedelmi vállalat szakosodott több tízezer különböző fehérje elleni antitestek ( monoklonális és poliklonális ) előállítására [3] .
A Western-blot módszert a molekuláris biológia , a biokémia , a genetika és más természettudományi területeken használják.
Más hasonló módszerek antitesteket használnak a szövetekben és sejtekben lévő fehérjék kimutatására immunfestéssel és enzimhez kötött immunszorbens vizsgálattal ( ELISA ) .
A Western blottingot George Stark stanfordi laboratóriumában fejlesztették ki . A Western Blot nevet W. Neal Burnette [4] adta a technikának, és egy szójáték a Southern Blot névből, egy DNS - detektáló technikából , amelyet korábban Edwin Southern fejlesztett ki . Az RNS meghatározására szolgáló hasonló módszert Northern blottingnak , a poszttranszlációs fehérjemódosítások kimutatását pedig Eastern blottingnak nevezik .
A minta vehető teljes szövetből vagy sejttenyészetből. A legtöbb esetben a kemény szöveteket először turmixgéppel (nagy térfogatú minták esetén), homogenizátorral (kisebb térfogatok esetén) vagy ultrahanggal őrlik . Ugyanakkor a baktériumok, vírusok és más környezeti összetevők fehérjeforrást is jelentenek.
Különféle detergensek , sók és pufferek használhatók a sejtlízis és a fehérjeoldódás javítására . Proteáz - és foszfatáz - inhibitorokat gyakran adnak hozzá , hogy megakadályozzák a minták megemésztését saját enzimeik által . A szövetek előkészítését gyakran alacsony hőmérsékleten végzik a fehérjedenaturáció elkerülése érdekében .
A biokémiai és mechanikai frakcionálási technikák kombinációi, beleértve a különböző típusú szűrést és centrifugálást , a különböző sejtkompartmentek és organellumok elválasztására szolgálnak .
A fehérjéket poliakrilamid gélelektroforézissel választják el. A fehérjék szétválasztása történhet izoelektromos pont (pI), molekulatömeg , elektromos töltés vagy e paraméterek kombinációja alapján.
A fehérjék szétválasztásának legáltalánosabb módszere az elektroforézis poliakrilamid gélben nátrium-dodecil-szulfát ( SDS ) jelenlétében , Laemmli szerint . [5] Az SDS a fehérjék denaturációját okozza, és denaturált állapotban tartja azokat; a diszulfidkötést redukáló szereket, mint például a ditiotreitol és a merkaptoetanol , a fehérjék másodlagos és harmadlagos szerkezetének elpusztítására használják . A denaturált polipeptidek az elektromos térben az akrilamid gélen keresztül az anódhoz vándorolnak , a kisebb fehérjék gyorsabban mozognak, és így a molekulatömegnek megfelelően szétválnak. Az akrilamid koncentrációja határozza meg a gél felbontását - minél nagyobb az akrilamid koncentrációja, annál jobb a kis molekulatömegű fehérjék felbontása. Az akrilamid alacsony koncentrációja javítja a nagy molekulatömegű fehérjék felbontását. Lehetőség van kétdimenziós elektroforézis (2-D) alkalmazására is . Ebben az esetben a fehérjék szétválasztása két irányban történik - az első irányban izoelektromos pontjuknak megfelelően, a másodikban pedig a molekulatömegnek megfelelően.
A gélen lévő mintákat felvisszük a zsebekre. Általános szabály, hogy az egyik „sáv” a molekulatömeg-markerek (ismert tömegű fehérjék keverékei) marad. A feszültség rákapcsolása után a fehérjék különböző sebességgel mozognak az elektromos térben. A haladás sebességében mutatkozó különbségek – elektroforetikus mobilitás – a fehérjék sávokra ( angol bands ) szétválásához vezetnek .
Annak érdekében, hogy a fehérjék elérhetővé váljanak az antitestek és a további kimutatás számára, azokat egy gélcsíkkal együtt nitrocellulózból vagy polivinilidén-fluoridból ( PVDF ) készült membránra visszük fel . A membránt felvisszük a gélre, és egy köteg szűrőpapírt helyezünk rá. A teljes köteg a transzfer pufferbe kerül, amely kapilláris hatás hatására felfelé mozgatja a papírt, és magával viszi a fehérjéket. A fehérjék átvitelének egy másik módszere az elektroblot , amely elektromos áramot használ a fehérjéknek a gélről a membránra történő átvitelére. A fehérjék a gélből a membránba mozognak, miközben megtartják helyüket. Ennek a "blotozásnak" (az angol blotting szóból ) eredményeként a fehérjék a detektáló membrán vékony felületi rétegén maradnak meg. Mindkét membránváltozatot nem specifikus fehérjekötő tulajdonságaik miatt alkalmazzák. A fehérjekötés a membrán és a fehérje közötti hidrofób kölcsönhatásokon és elektrosztatikus kölcsönhatásokon alapul. A nitrocellulóz membrán olcsóbb, mint a PVDF, de sokkal törékenyebb és kevésbé ellenáll az újracímkézésnek.
A fehérjéknek a gélből a membránba való átvitelének egységessége és általános hatékonysága a membrán Coomassie blue vagy Ponceau S festéssel ellenőrizhető . A Coomassie a kettő közül a gyakoribb, míg a Ponceau S érzékenyebb és vízoldhatóbb, ami megkönnyíti a membrán későbbi tisztítását és címkézését. [6]
Miután kiválasztottuk a membránt a fehérjékhez való képessége alapján, az antitestek és a célfehérje kiválasztása megtörtént, ügyelni kell arra, hogy elkerüljük a membrán és a célfehérje kimutatására használt antitest közötti kölcsönhatást (mivel az antitest maga is fehérje). A nem specifikus kötődés blokkolását úgy érik el, hogy a membránt híg fehérjeoldatba helyezik – általában szarvasmarha-szérumalbuminba vagy zsírmentes száraztejbe (mindkettő olcsó), kis százalékban detergenssel, például Tween 20 -zal vagy Triton X-100-zal . A híg oldatból származó fehérje minden olyan helyen rögzítődik a membránhoz, ahol a célfehérje nem tapadt. Ezért, amikor antitesteket adunk hozzá, az egyetlen szabad hely a membránon, ahol azok kapcsolódhatnak, a specifikus célfehérjék kötőhelyei. Ez a háttér "zaj" a végső Western blotban tiszta eredményeket és a hamis pozitív eredmények kiküszöbölését eredményezi.
A kimutatási folyamat során a membránt a kérdéses fehérjével "jelölik" egy módosított antitesttel, amely egy riporterenzimhez kötődik, amelyet megfelelő hordozón tartanak fenn, ami kolorimetriás reakcióhoz vezet és színt ad. Különböző okok miatt az észlelés két lépésben történik, bár bizonyos alkalmazásokhoz már elérhető egylépéses észlelési módszer.
Az antitesteket úgy állítják elő, hogy egy gazdaosztályt vagy immunsejtek tenyészetét valamilyen fehérjével (vagy annak egy részével) érintkeztetik. Ez általában az immunválasz része, de itt (a vizsgálatban) az összegyűjtött antitesteket specifikus és érzékeny kimutatási eszközként használják, amely közvetlenül kötődik a fehérjéhez.
A blokkolás után a hígított primer antitest oldatot (általában 0,5 és 5 µg/ml között) a membránnal inkubáljuk, és óvatosan összerázzuk. Az oldat általában pufferolt sóoldatból áll, kis százalékban mosószerrel, néha tejporból vagy BSA-ból. Az antitest oldatot és a membránt össze lehet zárni, és 30 perctől egész éjszakán át inkubálhatjuk. Különböző hőmérsékleteken is inkubálhatók; magasabb hőmérsékleten jobb kötődés figyelhető meg - specifikus (a célfehérjére, "signal1") és nem specifikus ("zaj") egyaránt.
A membrán öblítése után a meg nem kötött primer antitestek eltávolítása érdekében a membránt más antitesteknek teszik ki, amelyek közvetlenül kötődnek az elsődleges antitestek osztályspecifikus régióihoz. Ezeket másodlagos antitesteknek nevezik, és céltulajdonságaik szerint általában „egér-ellenes”, „anti-kecske”-nek stb. Az antitesteket állati forrásból (vagy hibridóma tenyészet állati forrásaiból ) nyerik; az egér elleni másodlagos antitestek a legtöbb egéreredetű elsődleges antitesthez kötődnek. Ez némi megtakarítást eredményez azáltal, hogy lehetővé teszi egy egyedi laboratórium számára, hogy egyetlen forrást használjon az antitestek tömeges előállításához, és sokkal reprodukálhatóbb eredményekhez vezet. A másodlagos antitestek általában biotinhoz vagy riporterenzimhez , például alkalikus foszfatázhoz vagy torma -peroxidázhoz kötődnek . Ez azt jelenti, hogy több másodlagos antitest kötődhet egy primer antitesthez, és erősítheti a jelet.
A kemilumineszcens ágens levágására a legáltalánosabb torma-peroxidázhoz kapcsolódó másodlagos antitesteket használják, és a reakciótermék a fehérje mennyiségével arányosan lumineszcens sugárzást bocsát ki. Egy fényérzékeny fényképező filmet helyeznek a membránra, és reakciósugárzásnak teszik ki, így a bloton kép jön létre az antitest sávokról. Olcsóbb, de kevésbé érzékeny megközelítés 1%-os hidrogén-peroxiddal kevert 4-klór-naftol festékkel ; a peroxidgyök 4-klór-naftollal való reakciója sötétbarna színt ad, amelyet speciális fényképezőfilm használata nélkül rögzítenek.
Az ELISPOT -hoz és az ELISA -hoz hasonlóan az enzim is ellátható szubsztrát molekulával, amelyet az enzim színes reakciótermékké alakít át, amely látható lesz a membránon (lásd lent a kék sávos ábrát).
Egy másik másodlagos antitest-detektálási módszer a közeli infravörösben (NIR) kibocsátó, kötött fluoroforral rendelkező antitesteket használ. A fluoreszcens festék által kibocsátott fény állandó, és a fluoreszcencia-detektálást pontosabb és érzékenyebb módszerré teszi a Western-bloton antitestekkel jelölt fehérjék által termelt jelek különbségének mérésére. A fehérjék számszerűsíthetők, mivel a jelet a membránon lévő összes fehérjéhez viszonyított, nyugalmi állapotban mért különbségként (sugárzásként) számítjuk ki a dinamikusan mért kemilumineszcencia (sugárzás) között. [7]
Egy harmadik alternatív módszer egy másodlagos antitesthez kötött enzim helyett radioaktív jelölést használ, például jelölt Staphylococcus Protein A típusú antitest-kötő fehérjét a jód radioaktív izotópjával. Más módszerek biztonságosabbak, gyorsabbak és olcsóbbak, ezért a radioaktív kimutatást ritkán alkalmazzák.
Történelmileg a jelölési eljárást két lépésben hajtották végre, mivel viszonylag egyszerűbb a primer és másodlagos antitestek különálló eljárásokban történő előállítása. Ez óriási előnyt jelent a kutatóknak és a vállalatoknak a rugalmasság terén, és egy erősítési lépést ad az észlelési folyamathoz. Tekintettel a nagy áteresztőképességű fehérjevizsgálatok megjelenésére és az alacsony kimutatási küszöbökre, továbbra is fennáll az érdeklődés egy olyan egylépéses címkézési rendszer kifejlesztése iránt, amely lehetővé teszi a folyamat gyorsabb és alacsonyabb költségű lefutását. Ez (egy lépésből álló rendszer) olyan antitest-címkéket igényel, amelyek felismerik a vizsgált fehérjét, és egyidejűleg hordoznak egy markert a kimutatáshoz – az ismert "fehérjefarok" számára leginkább hozzáférhető címkéket. Először a címkéket egy kétlépéses típusú membránnal inkubálják primer antitestekkel, majd mosássorozat után készen állnak a közvetlen kimutatásra.
A meg nem kötött címkék lemosása után a Western-blot készen áll a célfehérjéhez kötött próbák kimutatására. A gyakorlatban nem minden western mutat olyan fehérjéket, amelyek csak egy sávot tartalmaznak a membránon. A hozzávetőleges méretet a festett sávok elektroforézissel hozzáadott molekulatömeg-markerekkel való összehasonlításával számítjuk ki. A folyamatot meg kell ismételni olyan szerkezeti fehérjékkel, mint az aktin vagy a tubulin , amelyek nem változnak a kísérletek között. A célfehérje mennyisége a csoportok közötti kontroll szerkezeti fehérje mennyiségétől függ. Ez a technika hiba vagy hiányos átvitel esetén korrigálja a membránon lévő teljes fehérje mennyiségét.
A kolorimetriás kimutatási módszer egy Western-blot inkubálásán alapul, amely egy riporterenzimmel (például torma - peroxidázzal ) reagál , egy másodlagos antitesten "ülve" . Az oldható festék más színű oldhatatlan formává változik, az enzim mellett kicsapódik és megfesti a membránt. A foltok növekedését az oldható festék lemosása korlátozza. A fehérje szintjét denzitometriásan , a festés intenzitásával vagy spektrofotometriával határozzuk meg .
A kemilumineszcens kimutatási módszer egy nitrocellulóz membrán olyan szubsztráttal való inkubálásán alapul, amely egy másodlagos antitest riporterrel való kölcsönhatás után lumineszkál. A fényt egy fényképező film vagy CCD kamera rögzíti, amely digitálisan rögzíti a Western blotot. A képet denzitometriásan elemzik , megbecsülve a festett fehérje relatív mennyiségét, és kvantitatív eredményt adva az optikai sűrűség egységeiben. Az új szoftver további adatelemzést tesz lehetővé, például molekulatömeg-meghatározást, ha megfelelő szabványt alkalmaztak.
A radioaktív címkék nem igényelnek enzimszubsztrátokat, de lehetővé teszik az orvosi radiográfiás film Western-blot elé helyezését, lehetővé téve, hogy az (a film) kölcsönhatásba léphessen a címkékkel, és sötét területeket hozzon létre, amelyek megfelelnek a vizsgált fehérje sávjainak (pl. a jobb oldali kép). Csökken az igény a radioaktív kimutatási módszerek iránt magas költségek, magas egészségügyi és biztonsági kockázatok, valamint az ECL által biztosított alternatívák miatt.
A fluoreszkáló címkéket fény gerjeszti, és hosszabb hullámhosszú fényt bocsátanak ki, amelyet fotoszenzorok, például megfelelő emissziós szűrőkkel felszerelt CCD -kamera érzékelnek. A kamera digitális képet készít a Western blotról, ami lehetővé teszi a megszerzett adatok további elemzését, például molekulatömeg-elemzést és kvantitatív Western blot elemzést.