A fehérjeelektroforézis poliakrilamid gélben egy eljárás a fehérjék keverékeinek poliakrilamid gélben történő szétválasztására elektroforetikus mobilitásuk alapján ( a polipeptidlánc hosszának vagy molekulatömegének , valamint a fehérje molekula feltekeredésének függvénye, poszttranszlációs). módosítások és egyéb tényezők). A fehérje- és peptidfrakcionálásnak ezt a módszerét széles körben alkalmazzák a modern molekuláris biológiában , biokémiában és genetikában .
A poliakrilamid gél fehérjeelektroforézisének nagyszámú módosítását fejlesztették ki különféle problémák megoldására és különféle fehérjékre és peptidekre. A leggyakoribb változat a fehérje elektroforézis poliakrilamid gélben nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében a Laemmli ( SDS PAGE ) szerint .
A gélben lévő biopolimerek elektroforetikus mobilitása számos paramétertől függ. A migráció sebessége arányos a molekula töltésével, és szabad folyadékban az azonos fajlagos töltésű molekulák azonos sebességgel vándorolnak. Merev térbeli mátrixú közegben történő elválasztás esetén a géllel szembeni súrlódás következtében szegregáció következik be. A súrlódási erő a molekula térbeli konfigurációjától függ, beleértve a méretét is. Így a natív fehérjék elektroforetikus elválasztása esetén a fenti tényezők függvényében eloszlásuk összetett mintázata lesz megfigyelhető.
1970 -ben Laemmli egy módszert javasolt a fehérjék elektroforetikus szétválasztására poliakrilamid gélben a molekulatömegtől függően, hogy tanulmányozza a T4 bakteriofág kapszidjának összeállítási folyamatát [1] . Ehhez a gélre való felvitel előtt a mintákat nátrium-dodecil-szulfát (SDS) és 2-merkapto-etanol jelenlétében felforraltuk. A 2-merkaptoetanol hatására a diszulfid kötések helyreállnak, ami megakadályozza a denaturált polipeptidek kihurkolását és mobilitásuk növelését. Az SDS egy erős detergens , molekulája egy tizenkét tagú alifás egyenes láncból és egy ahhoz kovalensen kötött szulfátból áll, amely oldatban negatív töltésű.
A leírt módszer alkalmazásakor a következő feltételezéseket tesszük:
Ilyen körülmények között minden polipeptid azonos fajlagos töltéssel rendelkezik, és fordítottan különül el a molekulatömegük logaritmusával. A gyakorlat az esetek túlnyomó többségében megerősíti ezen feltételezések helyességét.
A denaturáló elektroforézis PAAG -ban történő lefolytatására különféle pufferrendszereket használnak. A leggyakoribb alapértelmezett rendszer a Laemmli pufferrendszer. Emellett a művek túlnyomó többsége az úgynevezett korong-elektroforézist (az angol diszkontinuous - diszkontinuous szóból) alkalmazza, vagyis két részből álló gélt használnak. A koncentráló gél pH-ja 6,8, a poliakrilamid koncentrációja 2-8%. Az elválasztó gél pH-ja 8,5-9, a poliakrilamid koncentrációja pedig 5-20%. A gélsűrűség megválasztása a vizsgált fehérjék molekulatömegétől függ. Minden puffer nem tartalmaz szervetlen sókat, a fő áramhordozó bennük a glicin . 6,8 pH-értéken a glicinmolekula teljes töltése nullához közelít. Ennek eredményeként egy bizonyos töltés átviteléhez (amelyet az elektroforetikus cellában lévő áram erőssége határoz meg) a negatív töltésű polipeptidek SDS-sel alkotott komplexeinek nagy sebességgel kell mozogniuk. 8,8 pH-értéken a glicin negatív töltést kap, aminek következtében a fehérjék élesen gátolódnak a koncentráló és elválasztó gélek határán (ma már sokkal több töltött molekula vesz részt ugyanazon töltés egységnyi területen keresztül történő átvitelében, ezért kisebb sebességgel mozognak). Ennek eredménye a fehérjék koncentrációja a gélek határfelületén, ami nagymértékben növeli a módszer felbontását.
Egy elválasztó gélben a fehérjék a polipeptidlánc hosszától függően vándorolnak, azaz fordítottan arányosak a molekulatömeggel.
Az elektroforézis eredményeinek megjelenítésére leggyakrabban a gélekben lévő fehérjék Coomassie festékkel vagy ezüsttel történő festését használják. Western -blothoz a fehérjéket a gélről egy nitrocellulóz membránra visszük át.
A legtöbb esetben elegendő az elektroforetikus elválasztás eredményét a gél vizuális értékelésével megszerezni. A megbízható adatok beszerzése és az eredmények megfelelő dokumentálása érdekében azonban a gélt egy nagyon érzékeny denzitométerrel átvitel útján szkenneljük. Valójában a denzitométer egy olyan szkenner, amely a vezérlő- és mérőműszerekhez tartozik, és ellenőrzés alá tartozik annak megállapítása és megerősítése, hogy a mérőműszer jellemzői megfelelnek a megállapított követelményeknek. A denzitométerrel szembeni ilyen követelmények lehetővé teszik nemcsak a fehérjék helyzetének megbízható meghatározását a gélben, hanem a fehérjefolt optikai sűrűségét is. A gél digitalizált képét speciális szoftverrel dolgozzák fel, amely lehetővé teszi olyan paraméterek megbízható meghatározását, mint a fehérje elektroforetikus mobilitása, tisztasága, a fehérje mennyisége a foltban stb.
A fehérjék molekulatömegének meghatározásaA vizsgált fehérje molekulatömegének meghatározásához a gélt molekulatömegek alapján kell kalibrálni. A gélt a vizsgált mintával párhuzamosan elválasztott markerfehérjék molekulatömegéhez kell kalibrálni. A marker fehérjék keverékei különböző súlytartományokban állnak rendelkezésre. A kalibrálás magában foglalja az egyes markerfehérjék relatív elektroforetikus mobilitása (Rf) függését a molekulatömegük decimális logaritmusától . Jellemzően a függőség szigmoid görbe formájú. A vizsgált fehérje molekulatömegének kiszámítása az Rf értékéhez viszonyítva történik, a regressziós analízis módszerével . Az eredmények akkor tekinthetők megbízhatónak, ha a markerfehérjék tartománya az elválasztógél hosszának legalább 80%-a, és Rf-ük függése a molekulatömeg logaritmusától lineáris (R 2 > 0,95). Azaz a kalibrációs görbének csak azt a szakaszát használjuk a számításokhoz, amely a vizsgált fehérje elektroforetikus mobilitását fedi le.
Az SDS-PAGE módszer érzékenysége Laemmli szerint fordítottan arányos a fehérje molekulatömegével. Például 10-20 kDa tartományban el lehet választani olyan fehérjéket, amelyek csak 0,1 kDa- ban különböznek egymástól (a különbség csak egy aminosav ). A kielégítő eredmények eléréséhez azonban be kell tartani néhány egyszerű módszertani ajánlást. Tekintettel tehát arra, hogy a vizsgált minták nagy elektromos vezetőképessége jelentősen torzíthatja a fehérje elektroforetikus mobilitását, ionerősségük a lehető legkisebb és megközelítőleg egyenlő legyen. A molekulatömeg-meghatározás megbízhatóságának másik fontos feltétele a fehérje optimális terhelése a gélben. Coomassie Blue R250 festéskor a folt optimális fehérjetartalmának 0,1-1 µg tartományban kell lennie, ezüsttel festve pedig legalább egy nagyságrenddel kisebbnek kell lennie. Ellenkező esetben a gélben lévő fehérjék széles foltokat képeznek, ami megnehezíti elektroforetikus mobilitásuk meghatározását. A módszer nagy érzékenysége és egyszerűsége ellenére a fehérjék SDS-PAGE-val meghatározott molekulatömege gyakran eltér a valódi értéktől. A különbség a kis molekulatömegű fehérjék esetében néhány kDa-tól a nagy molekulatömegű fehérjék esetében több tíz kDa-ig terjedhet.
A fehérjék mennyiségi meghatározásaAz SDS-PAGE módszer nélkülözhetetlen, ha olyan egyedi fehérjét kell mennyiségileg meghatározni egy olyan mintában, amely nem csak fehérje összetételében összetett. Ilyen minták például a nyers extraktumok vagy sejtlizátumok. Ebben az esetben a módszer alkalmas mind a natív, mind a szerkezetüket megváltoztatott fehérjék vizsgálatára. Az ilyen fehérjék lehetnek polimerek, aggregátumok vagy teljesen denaturált molekulák. A módszer viszonylagos igénytelensége a minta összetétele és a benne lévő fehérjék szerkezeti állapota tekintetében kedvezően különbözteti meg az SDS-PAGE-t más mennyiségi meghatározási módszerektől, például a nagy teljesítményű folyadékkromatográfiától vagy az enzim immunoassay-től.
A fehérje mennyiségi meghatározása SDS-PAGE-val azt sugallja, hogy a gélt kalibrálni kell a gélben lévő fehérjefolt színintenzitásának és a foltban lévő fehérje mennyiségének függvényében. Ennek érdekében a vizsgált mintákkal párhuzamosan több referenciamintát választanak le a gélben pontosan ismert különböző mennyiségű referenciafehérjével. A gélben lévő fehérjék denzitométerrel történő megjelenítése után megmérjük a referenciaminták minden fehérjefoltjának sűrűségét. Határozza meg ennek a sűrűségnek a függőségét a fehérje mennyiségétől! A kalibrált gélt használjuk a vizsgált fehérje mennyiségének a folt sűrűségéhez viszonyított kiszámításához, a regressziós analízis módszerével . Megbízható eredményeket akkor tekintünk, ha a referenciafehérje fehérjefoltjainak sűrűsége a foltban lévő fehérje mennyiségétől lineáris (R 2 > 0,95). Azaz a számításokhoz a kalibrációs görbének csak azt a szakaszát használjuk, amely lefedi a vizsgált fehérje foltjának sűrűségét. Megjegyzendő, hogy a vizsgált mintában az optimális fehérjekoncentráció kiválasztása empirikusan történik.
A fehérjék SDS-PAGE-val történő mennyiségi meghatározásakor ennek a módszernek az egyik jelentős jellemzőjét figyelembe kell venni. Tehát, mivel a gélben lévő fehérje színezésének hatékonysága függ annak természetétől, például az aminosav-összetételtől, a molekulatömegtől, a protetikus csoportok jelenlététől , a gél és a vizsgált fehérje kalibrálásához használt referenciafehérjét kell használni. azonosak legyenek. Ettől a szabálytól való eltérés esetén a valós és a kapott összeg közötti eltérés többszörösére is eltérhet.
Fehérje szennyeződések meghatározásaA Laemmli szerinti SDS-PAGE módszer csak azon szennyeződések mennyiségi meghatározását teszi lehetővé, amelyek molekulatömege eltér a vizsgált fehérje molekulatömegétől. Ehhez a vizsgálati mintát egy gélben elválasztják egy vagy több referenciamintával párhuzamosan, amelyekben a referenciafehérje mennyisége összemérhető a vizsgált fehérjeoldatban lévő szennyeződések várható mennyiségével. Például, ha a vizsgált mintában a fehérjekoncentráció 1 mg/ml, és a benne lévő szennyeződések várható mennyisége 1%-on belül van, akkor legalább egy 10 µg/ml koncentrációjú referencia fehérjeoldatot kell referenciaként használni. minta. A gélben lévő fehérjék denzitométerrel történő megjelenítése után minden fehérjefolt sűrűségét megmérjük a vizsgálati minta és a referenciaminta esetében.
Az SDS-PAGE módszer alkalmas olyan fehérje dimerek és polimerek meghatározására, amelyek a molekulák közötti diszulfid kötések spontán bezáródása miatt halmozódnak fel , például a gyógyszer nem megfelelő tárolása során. Ehhez a vizsgált fehérjét és a referenciafehérjét redukáló és nem redukáló körülmények között gélben elválasztják. A szennyeződések dimerek és polimerek, ha redukáló körülmények között kimutathatók, és nem redukáló körülmények között nem. Ebben az esetben molekulatömegüknek a vizsgált fehérje molekulatömegének többszörösének kell lennie. Így egy fehérjekészítmény tisztaságának SDS-PAGE-val redukáló körülmények között történő értékelése lehetővé teszi csak a nem homológ fehérjeszennyezések meghatározását.
A minta tisztaságának meghatározásának eredménye lehet félkvantitatív vagy kvantitatív. Abban az esetben, ha a szennyező fehérjék foltjainak sűrűségét egy referenciafehérje egy foltjához viszonyítva összehasonlítják, a kapott eredmény félkvantitatív. Megszövegezése például így hangozhat: "A vizsgálati oldat fehérjeszennyeződés-tartalma nem haladja meg az 1%-ot." A fehérjeszennyeződések mennyiségi meghatározását a fehérjék SDS-PAGE módszerrel történő kvantitatív meghatározására vonatkozó ajánlások szerint végezzük.
A leírt megközelítéseken kívül néhány laboratórium alkalmaz egy módszert a készítmény homogenitásának meghatározására referenciaminták használata nélkül. Ebben az esetben a vizsgált fehérje tisztaságát a gélben lévő folt sűrűsége határozza meg, amelyet az összes azonosított fehérjefolt sűrűségének összegének százalékában becsülnek meg. Ez a megközelítés nem tükrözi a szennyeződések valódi mennyiségét, de a gyógyszer tisztaságának minőségi értékeléseként szolgálhat. A módszer nem minősíthető kvantitatívnak, mivel a kimutatott fehérjefoltok száma és sűrűsége egyenesen arányos a vizsgált mintában lévő összes fehérje mennyiségével és a gélben lévő fehérjék meghatározására szolgáló módszer érzékenységével. Ráadásul a fehérjefolt sűrűségének függése a benne lévő fehérje mennyiségétől egy nagyságrendet meghaladó tartományban gyakran nem lineáris.
Poliakrilamid gélben végzett fehérjeelektroforézishez a következő pufferoldatokat használjuk: Tris - HCl , Tristricin , TBE , TBE karbamiddal, Bis-Tris.