Kapilláris elektroforézis

A kapilláris elektroforézist , más néven kapilláris zonális elektroforézist ( CZE ), az ionok töltés általi elválasztására használják . Hagyományos elektroforézis esetén a töltött molekulák egy vezetőképes folyadékban elektromos tér hatására mozognak . Az 1960-as években egy kapilláris elektroforézis technikát javasoltak molekulák töltés és méret szerinti szétválasztására egy elektrolittal töltött vékony kapillárisban .

Berendezés

A kapilláris elektroforézis viszonylag egyszerű berendezést igényel. A kísérlet sémája az 1. ábrán látható . A rendszer fő elemei az alkalmazási fiola, az indítófiola, a végső fiola, a kapilláris, az elektródák, a nagy teljesítményű tápegység, az érzékelő és az adatfeldolgozó eszköz. A mintafelhordó palackot, az indítópalackot és a végpalackot elektrolittal, például vizes pufferoldattal töltik fel. A minta felviteléhez a kapilláris végét a mintaüvegbe mártjuk, majd átvisszük az indítófiolába. Az elemzett anyagok mozgása elektromos tér hatására történik. Az összes ion a kapilláris mentén egy irányba mozog elektroozmotikus áram hatására. Az analitokat elektroforetikus mobilitás választja el, és a kapilláris végének közelében detektálható. [egy]

Észlelés

A kapilláris elektroforézis során elválasztott molekulák kimutatása különféle eszközökkel végezhető el. A legelterjedtebb eszközök az ultraibolya tartományban vagy a látható fény tartományában észlelik a sugárzás elnyelésének változásait. Az ilyen rendszerekben jellemzően a kapilláris egy részét használják sejtként. Az áteresztett fény úthossza kapilláris elektroforézisben 50 mikrométer nagyságrendű, ami jóval kevesebb, mint a hagyományos ultraibolya cellák esetében, amelyekben a fény úthossza 1 centiméter nagyságrendű.

A Bouguer-Lambert-Beer törvény szerint a detektor érzékenysége arányos annak az útnak a hosszával, amelyet a fény áthalad a cellán. Az érzékenység növelése érdekében a fény útja meghosszabbodik, de a cella méretének növekedésével a felbontás csökken. A kapilláris cső a detektálás helyén kitágítható, ezt a fajtát buborékcellának nevezzük. Egy másik lehetőségnél az áteresztett fény útjának növelését egy további kapilláris hozzáadásával érik el (lásd a 2. ábrát ). Mindkét módszer csökkenti az elválasztás hatékonyságát. [2]

A fluoreszcenciadetektálás természetes fluoreszcens minták vagy fluoreszcens jelöléseket bevezető kémiai módosítások kapilláris elektroforézisében használható. Ez a kimutatási módszer nagy érzékenységet biztosít, de nem használható nem fluoreszcens minták kimutatására. Lézer-indukált fluoreszcencia detektálást is alkalmaznak, az ilyen kapilláris elektroforézis rendszerek 10 -18 - 10 -21 mol tartományban képesek kimutatni.

A hasonló minták megkülönböztetése érdekében a kapilláris elektroforézises elválasztó rendszerek közvetlenül csatlakoztathatók tömegspektrométerekhez. A legtöbb ilyen rendszerben a kapilláris végét egy elektroaeroszolos ionizáló berendezésbe helyezik . Az ionizált részecskéket tömegspektrometriával tovább elemzik. [2]

Elválasztási módszerek

A molekulákat kapilláris elektroforézis választja el az alkalmazott elektromos térben való mobilitásbeli különbségek miatt. Az elválasztott molekulák mozgási sebessége ( ) az alkalmazott térben az ellentétes töltésű elektródához képest: $u_{p}$

$u_{p}=\mu _{p}E$

ahol az elektroforetikus mobilitás és E az elektromos tér erőssége. Az elektroforetikus mobilitás arányos az ion töltésével. Abban az esetben, ha a minta kétféle, töltésükben eltérő molekulából áll, az elektroforézis hatására szétválás következik be. Egy anyag elektroforetikus mobilitása adott pH-értékek mellett: $\mu _{p}$

$\mu _{p}={\frac {z}{6\pi \eta r))$

ahol a molekula fajlagos töltése és a molekula Stokes sugara: ${\megjelenítési stílus {z))$ $r$

$r={\frac {k_{B}T}{6\pi \eta \ D}}$

ahol a Boltzmann-állandó és a hőmérséklet, és D a diffúziós együttható . Ezek az egyenletek azt mutatják, hogy egy molekula elektroforetikus mobilitása arányos a töltéssel és fordítottan arányos a sugarával. Az elektroforetikus mobilitás kísérletileg meghatározható a molekula adott erősségű elektromos térben való mozgásának idejéből: $k_B$ $T$

$\mu _{p}=\left({\frac {L}{t_{r}}}\right)\left({\frac {L_{t}}{V}}\right)$

ahol a távolság a kiindulási ponttól a detektálási helyig, az az idő, amely alatt az elemzett molekula eléri a kimutatási pontot, az elektromos térerősség és a kapilláris teljes hossza. [2] Mivel az elektromos tér csak töltött molekulákra hat, a töltetlen molekulákat kapilláris elektroforézissel gyengén elválasztják. $L$ $t_{r}$ $V$ ${\displaystyle L_{t))$

Az elemzett molekulák mozgási sebessége a kapilláris elektroforézis során a pufferben lévő elektroozmotikus áramlás nagyságától függ. Általában az elektroozmotikus áramlás a negatív töltésű katód felé irányul. Az elektroforetikus mobilitásban eltérő molekulák az ellentétes töltésű elektród felé mozognak. [1] A negatív töltésű részecskék a pozitív töltésű anód felé, a pozitív töltésű részecskék a katód felé az elektroozmotikus áramlás irányában (lásd 3. ábra ).

Az elektroozmotikus áramlási sebesség a következőképpen ábrázolható: $u_{o}$

$u_{o}=\mu _{o}E$

ahol az elektroozmotikus mobilitás egyenlő: $\mu _{o}$

$\mu _{o}={\frac {\epsilon \zeta }{\eta }}$

ahol a kapillárisfal potenciálja, és a pufferoldat relatív permittivitása. Az elektroozmotikus mobilitás a semleges töltésű molekulák késleltetési idejének mérésével határozható meg. [2] Az elemzett molekula mozgási sebessége ( ) elektromos térben a következőképpen ábrázolható: $\zeta$ $\epsilon$ $u$

$u_{p}+u_{o}=(\mu _{p}+\mu _{o})E$

Tekintettel arra, hogy a pufferoldat elektroozmotikus áramlása általában nagyobb, mint a vizsgált anyagok elektroforetikus áramlása, minden vizsgált molekula a pufferoldattal együtt mozog a katód felé. A negatív töltésű molekulák hosszabb ideig maradnak a kapillárisban az elektroforetikus mobilitásuk ellentmondásai miatt. [1] A töltött molekulák mozgási sorrendjét a 3. ábra mutatja : a kis kationok gyorsan mozognak, a kis többszörösen töltött anionok erősen késleltetik. [2]

Hatékonyság és felbontás

Az elméleti lemezek számát, illetve kapilláris elektroforézis esetén az elválasztási hatékonyságot a következő egyenlet adja meg:

${\displaystyle N={\frac {\mu V}{2D_{m))))$

ahol az elméleti lemezek száma, a látszólagos mobilitás az elválasztó közegben, és az elválasztandó anyag diffúziós együtthatója. Ezen egyenlet szerint az elválasztási hatékonyságot csak a diffúzió korlátozza, és arányos az elektromos tér erősségével. A kapilláris elektroforézissel végzett elválasztás hatékonysága általában sokkal magasabb, mint más elválasztási eljárásoké, például a nagy teljesítményű folyadékkromatográfiáé . A HPLC-vel ellentétben kapilláris elektroforézis esetén nincs tömegátadás a fázisok között. [2] Az elektroozmotikus áramlási rendszerek esetében az áramlási profil lapos, ellentétben a kromatográfiás oszlopok lamináris profiljával, amelyekben az elválasztás nyomás alatt történik (lásd 5. ábra ). Ennek eredményeként az elektroozmotikus elválasztás során nem történik sávtágulás, mint a kromatográfiában. A kapilláris elektroforézissel végzett elválasztás több százezer elméleti lemezt tartalmazhat. [3] $N$ $\mu$ ${\displaystyle D_{m))$

A kapilláris elektroforézises elválasztás felbontása ( ) a következőképpen írható fel: $R_{s}$

$R_{s}={\frac {1}{4))\left({\frac {\triangle \mu _{p}{\sqrt {N))}{\mu _{p}+\ mu _{o}}}\jobbra)$

Ennek az egyenletnek megfelelően a maximális felbontást az elektroforetikus és elektroozmotikus mobilitások hasonló értékeinél érik el, de ellenkező előjellel. Ezenkívül a nagy felbontás alacsony sebességet igényel, és ennek megfelelően több elválasztási időt igényel. [2]

Kapcsolódó módszerek

A kapilláris elektroforézissel történő elválasztás az elválasztandó molekulák elektroforetikus mobilitásában mutatkozó különbségeken alapul. A molekulák bizonyos osztályait azonban nem lehet szétválasztani, mert töltetlenek, vagy elektroforetikus mobilitásukban kissé eltérnek egymástól. A semleges (töltetlen) mintakomponensek elkülönítésére micelláris elektrokinetikus kromatográfiát (MEKC) használnak , amelyben felületaktív anyagokat adnak a pufferoldathoz, micellákat képezve . A töltött polimerek, például a DNS, géllel töltött kapillárisokban választhatók szét; a gél jobban lelassítja a hosszabb molekulákat, mint a rövidebbeket. A kapilláris elektroforézis ezen változatát kapilláris gélelektroforézisnek nevezik. Néhány kapilláris elektroforézis rendszer mikroméretű kromatográfiához használható. A kapilláris elektroforézis rendszerek is használhatók izotachoforézishez , izoelektromos fókuszáláshoz és affinitáselektroforézishez .

Jegyzetek

↑ 1 2 3 4 Skoog, D.A.; Holler, FJ; Crouch, S. R. "Principles of Instrumental Analysis" 6. kiadás. Thomson Brooks/Cole Publishing: Belmont, CA 2007 .
↑ 1 2 3 4 5 6 7 Skoog, D.A.; Holler, FJ; Crouch, S. R. "Principles of Instrumental Analysis" 6. kiadás. 30. fejezet Thomson Brooks/Cole Publishing: Belmont, CA 2007 .
↑ Skoog, D.A.; Holler, FJ; Nieman, TA "Principles of Instrumental Analysis, 5. kiadás." Saunders College Kiadó: Philadelphia, 1998 .

Irodalom

Terabe, S.; Otsuka, K.; Ichikawa, K.; Tsuchiya, A.; Ando, T. Anal. Chem . 1984 , 56 , 111.
Terabe, S.; Otsuka, K.; Ichikawa, K.; Tsuchiya, A.; Ando, T. Anal. Chem . 1984 , 56 , 113.
Foley, JP Anal. Chem . 1990 , 62 , 1302.
Carretero, AS; Cruces-Blanco, C.; Ramirez, S.C.; Pancorbo, AC; Gutierrez, A. F. J. Agric. étel. Chem . 2004 , 52 , 5791.
Cavazza, A.; Corradini, C.; Laura, A.; Nicoletti, I. J. Agric. élelmiszer-kémia . 2000 , 48 , 3324.
Rodrigues, MRA; Caramao, EB; Arce, L.; Rios, A.; Valcarcel, M. J. Agric. élelmiszer-kémia . 2002 , 50 , 4215.

Lásd még

elektroforézis

Linkek

A kapilláris elektroforézis animációja
Kapilláris elektroforézis szakértőknek és kezdőknek Archiválva : 2015. május 4. a Wayback Machine -nél