A DNS- agaróz gélelektroforézis egy olyan analitikai módszer, amelyet a DNS- fragmensek hosszúság szerinti elválasztására használnak. A különböző hosszúságú töredékek eltérő mozgási sebességén alapul, amikor a gélben külső elektromos tér hatására mozognak .
A módszer egyik alkalmazása a plazmid DNS vizsgálata. Általában gyűrű alakú, és másodlagos szerkezeteket képez, például szupertekercské tekercselve . Így a plazmid méretének meghatározásához meg kell semmisíteni a másodlagos szerkezet elemeit. Ehhez a gélre való felvitel előtt a plazmidot „linearizálják” (lineárissá teszik), vagyis az egyik restrikciós enzimmel (endonukleázokkal) kezelik. A restrikciós enzimet úgy választjuk meg, hogy csak egy helyen vágja el a plazmidot.
A különböző hosszúságú DNS-fragmensek elválasztásához különböző koncentrációjú agarózt tartalmazó gélt használnak. Minél rövidebb az elválasztandó DNS-fragmensek hossza, annál nagyobbnak kell lennie az agaróz koncentrációjának:
| Az elválasztandó DNS-fragmensek hossza , bp |
Agaróz koncentráció , % |
|---|---|
| 50-1500 | 2 |
| 300-3000 | 1.5 |
| 400-6000 | 1.2 |
| 500-10000 | egy |
| 800-10000 | 0.7 |
| 1000-20000 | 0.5 |
Az elektroforézis során a DNS-fragmensek elektromos térerők hatására vándorolnak a gélben . A tény az, hogy a DNS-molekulák cukor-foszfát gerince negatív töltésű, ezért a DNS-láncok a negatív töltésű katódról a pozitív anódra mozognak . A hosszabb molekulák lassabban vándorolnak, mivel a gélben maradnak, a rövidebb molekulák gyorsabban mozognak.
Az elektroforézis megkezdése előtt szokás két különböző savas pH-jú színezéket hozzáadni a mintákhoz (a xilolkéket és a bróm-fenolkéket gyakran használják erre a célra ), hogy láthatóvá tegyék az elektroforézis előrehaladását, és a mintákat glicerinnel (legfeljebb 20% glicerinnel) súlyozzák. a mintában). A festékre azért is szükség van, hogy meghatározzuk, mikor kell leállítani a folyamatot.
Az elektroforézist pufferoldattal töltött kamrában végezzük . A leggyakrabban használt pufferek EDTA -t , Tris -t és bórsavat vagy ecetsavat tartalmaznak. Ennek megfelelően a bórsavat tartalmazó puffert TBE-nek (tris-borate-EDTA), az ecetsavat tartalmazó puffert TAE -nek (tris-acetate-EDTA) nevezzük. A TBE és a TAE anyalúgok koncentrációja 6-szoros, illetve 50-szerese a munkakoncentrációjukhoz viszonyítva. A puffer szükséges annak az oldatnak az ionerősségének növeléséhez , amelyben a DNS-molekulák szétválása megtörténik az alkalmazott elektromos tér hatására.
Az elválasztás után (néha a festéket olvadt agarózhoz adják) a különböző hosszúságú DNS-fragmenseket olyan fluoreszcens festékekkel teszik láthatóvá, amelyek specifikusan kölcsönhatásba lépnek a DNS-sel, például az agarózgéleket általában etidium-bromiddal festik meg , amely a duplex nitrogénbázisai közé interkalálódik. és fluoreszkál az UV sugárzásban.
A méretezést a kereskedelmi forgalomban lévő ismert hosszúságú DNS-fragmensek ("DNS-létra", "vonalzó", "DNS-markerek") és a vizsgált minták DNS-ének összehasonlításával végezzük. Általában a kereskedelmi markerekben is feltüntetik az egyes fragmentumok tartalmát, így a sávok intenzitásának összehasonlításával gyorsan meg lehet határozni a vizsgált minták DNS-koncentrációját. Szükség esetén a gél DNS-markerei egymástól függetlenül is előállíthatók, ha a plazmidot restrikciós enzimmel kezeljük, amely több helyen elvágja. Ehhez egy endonukleázt választanak ki, amelynek hatására 5-6 különböző hosszúságú fragmens képződik.
Általában agaróz géleket használnak a DNS elektroforetikus analízisére, de ha az elválasztandó DNS-fragmensek csak néhány tíz bázispár hosszúak, akkor poliakrilamid gél használható. A poliakrilamid gélt nagy felbontású rövid DNS-molekulákhoz is használják a DNS- szekvenálás során .