Polimeráz láncreakció

A polimeráz láncreakció ( PCR ) egy olyan molekuláris biológiai módszer, amely lehetővé teszi bizonyos nukleinsav-fragmensek ( DNS vagy RNS ) kis koncentrációjának jelentős növekedését a biológiai anyagban (mintában).

A DNS- amplifikáció mellett a PCR számos egyéb nukleinsavakkal végzett manipulációt tesz lehetővé ( mutációk bevezetése , DNS-fragmensek splicingje), és széles körben alkalmazzák a biológiai és orvosi gyakorlatban, például betegségek (örökletes, fertőző) diagnosztizálására, apaság megállapítására , gének klónozására , új gének izolálására .

Történelem

Az 1970-es évek elején a norvég tudós, Kjell Kleppe , a Nobel-díjas Hara Gobinda Korana laboratóriumából egy olyan módszert javasolt a DNS- amplifikációra , amely egy pár rövid egyszálú DNS-molekulát – szintetikus primereket használ fel [1] . Ekkor azonban ez az ötlet megvalósítatlan maradt. A polimeráz láncreakciót (PCR) 1983-ban találta fel Kary Mullis amerikai biokémikus [2] [3] . Célja egy olyan módszer létrehozása volt, amely lehetővé teszi a DNS-amplifikációt az eredeti DNS-molekula többszöri, egymást követő megkettőzése során a DNS-polimeráz enzim segítségével . A PCR-módszerrel kapcsolatos első publikáció 1985 novemberében jelent meg a Science folyóiratban [4] . A módszer forradalmasította a molekuláris biológiát és az orvostudományt. 1993-ban Kary Mullis ezért kapott kémiai Nobel-díjat [5] .

A módszer alkalmazásának kezdetén minden fűtési-hűtési ciklus után DNS-polimerázt kellett a reakcióelegyhez adni , mivel az inaktiválódott a DNS-spirál szálainak elválasztásához szükséges magas hőmérsékleten. A reakcióeljárás viszonylag nem volt hatékony, sok időt és enzimet igényelt. 1986- ban a polimeráz láncreakciós módszert jelentősen továbbfejlesztették. Termofil baktériumokból származó DNS-polimerázok alkalmazását javasolták [6] . Ezek az enzimek hőstabilnak bizonyultak, és számos reakcióciklust képesek voltak ellenállni. Használatuk lehetővé tette a PCR egyszerűsítését és automatizálását. Az egyik első hőstabil DNS polimerázt Thermus aquaticus baktériumból izolálták, és a Taq polimeráz nevet kapta . Ennek a polimeráznak a hátránya a hibás nukleotid bejuttatásának meglehetősen nagy valószínűsége, mivel ez az enzim nem rendelkezik hibajavító mechanizmusokkal (3'→5' - exonukleáz aktivitás). Az archaeából izolált Pfu és Pwo polimerázok rendelkeznek ilyen mechanizmussal; használatuk jelentősen csökkenti a mutációk számát a DNS-ben, de munkájuk sebessége (proceszivitása) alacsonyabb, mint a Taq -é . A Taq és Pfu keverékeit ma már nagy polimerizációs sebesség és nagy másolási pontosság eléréséhez is használják.

A módszer feltalálása idején Kary Mullis szintetikus vegyészként dolgozott (oligonukleotidokat szintetizált, amelyeket aztán genomi DNS-sel hibridizációval pontmutációk kimutatására használtak) a PCR-módszert szabadalmaztató Cetus Corporationnél 1992-ben a Cetus 300 millió dollárért eladta a módszer jogait és a Taq polimeráz használatára vonatkozó szabadalmat a Hofmann-La Roche- nak. Kiderült azonban, hogy a Taq -polimerázt A. Kaledin , A. Slyusarenko és S. Gorodetsky szovjet biokémikusok jellemezték 1980-ban [7] , valamint 4 évvel e szovjet publikáció előtt, azaz 1976-ban Alice amerikai biokémikusok. Chien, David B. Edgar és John M. Trela ​​[8] . Ennek eredményeként a Promega bírósági úton próbálta rákényszeríteni a Roche-t, hogy mondjon le az enzimre vonatkozó kizárólagos jogairól [9] . A PCR-módszer amerikai szabadalma 2005 márciusában járt le.

PCR lefolytatása

A módszer a DNS -nukleinsav egy bizonyos szakaszának többszöri szelektív másolására épül enzimek segítségével mesterséges körülmények között ( in vitro ). Ebben az esetben csak az a terület kerül másolásra, amely megfelel a meghatározott feltételeknek, és csak akkor, ha az jelen van a vizsgált mintában. Ellentétben a DNS-amplifikációval az élő szervezetekben ( replikáció ), a DNS viszonylag rövid szakaszait PCR amplifikálja . Egy hagyományos PCR eljárásban a replikált DNS-régiók hossza nem haladja meg a 3000 bázispárt (3 kbp [10] ). Különböző polimerázok keverékének segítségével, adalékok használatával és bizonyos feltételek mellett egy PCR-fragmens hossza elérheti a 20-40 ezer bázispárt is. Ez még mindig sokkal kevesebb, mint egy eukarióta sejt kromoszómális DNS-ének hossza. Például az ember legrövidebb nukleáris kromoszómájának (21. kromoszóma) hossza 46,71 millió bázispár [11] .

Reakció komponensek

A PCR-hez a legegyszerűbb esetben a következő összetevőkre van szükség:

• Az amplifikálandó DNS szakaszt tartalmazó DNS-templát .
• Két primer , amelyek komplementerek a kívánt DNS-fragmens különböző szálainak ellentétes végeivel.
• A hőstabil DNS polimeráz egy  olyan enzim , amely a DNS polimerizációját katalizálja. A PCR-ben használt polimeráznak hosszú ideig aktívnak kell maradnia magas hőmérsékleten, ezért termofilekből izolált enzimeket használnak - Thermus aquaticus ( Taq polimeráz ), Pyrococcus furiosus ( Pfu polimeráz), Pyrococcus woesei ( Pwo polimeráz), Thermus thermophilus ( Tth- polimeráz) és mások.
• Dezoxiribo nukleozid-trifoszfátok (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• A polimeráz működéséhez szükséges Mg 2+ ionok .
• A szükséges reakciókörülményeket - pH , az oldat ionerőssége - biztosító pufferoldat . Sókat, marhaszérum albumint tartalmaz .

A reakcióelegy elpárolgásának elkerülése érdekében magas forráspontú olajat, például vazelint adunk a kémcsőbe. Ha fűtött fedős ciklust használ, erre nincs szükség.

Pirofoszfatáz hozzáadása növelheti a PCR hozamát. Ez az enzim katalizálja a pirofoszfát hidrolízisét , amely a nukleozid-trifoszfátok növekvő DNS-szálhoz való hozzáadásának mellékterméke, az ortofoszfáttá . A pirofoszfát gátolhatja a PCR-t [12] .

Alapozók

A PCR specifitása a templát és a primerek , rövid, 18-30 bázis hosszú szintetikus oligonukleotidok közötti komplementer komplexek képződésén alapul . A primerek mindegyike komplementer a kétszálú templát egyik láncához, és korlátozza az amplifikált régió kezdetét és végét.

A templát primerrel való hibridizálása (annealing [13] ) után az utóbbi a DNS-polimeráz primerjeként szolgál a templát komplementer szálának szintézise során (lásd alább ).

A primerek legfontosabb jellemzője a primer-mátrix komplex olvadási hőmérséklete (T m ).

Tm az  a hőmérséklet, amelyen a DNS-templátok fele komplexet képez az oligonukleotid primerrel. A rövid oligonukleotid (és a hosszú DNS-fragmensek) T m kiszámításának átlagos képlete , figyelembe véve a K + -ionok és a DMSO koncentrációját :

ahol  a nukleotidok száma a primerben,  a káliumionok moláris koncentrációja,  az összes guanin és citozin összege .

Ha a primer hosszát és nukleotid összetételét vagy az összekapcsolási hőmérsékletet nem megfelelően választják meg, akkor a templát DNS más régióival részlegesen komplementer komplexek képződhetnek, amelyek nem specifikus termékek megjelenéséhez vezethetnek. Az olvadási hőmérséklet felső határát a polimeráz optimális működési hőmérséklete korlátozza, amelynek aktivitása 80 °C feletti hőmérsékleten leesik.

Az alapozók kiválasztásakor kívánatos a következő kritériumok betartása:

• GC összetétel ~ 40-60%;
• közeli T m primerek (az eltérések legfeljebb 5 °C);
• nem specifikus másodlagos struktúrák hiánya - hajtűk [15] és dimerek [16] ;
• guanin vagy citozin kívánatos a 3'-végen , mivel ezek három hidrogénkötést képeznek a templátmolekulával, stabilabbá téve a hibridizációt.

Erősítő

A PCR-t egy erősítőben hajtják végre  - olyan eszközben, amely a kémcsövek időszakos hűtését és melegítését biztosítja, általában legalább 0,1 ° C-os pontossággal. A modern ciklusok lehetővé teszik összetett programok beállítását, beleértve a "hot start", a Touchdown PCR (lásd alább) lehetőségét és az amplifikált molekulák ezt követő tárolását 4 °C-on. A valós idejű PCR-hez fluoreszcens detektorral felszerelt eszközöket gyártanak. A műszerek automata fedéllel és mikrolemez rekesszel is kaphatók, így automatizált rendszerekbe integrálhatók.

A reakció lefolyása

A PCR végrehajtása során általában 20-35 ciklust hajtanak végre, amelyek mindegyike három szakaszból áll. [≡]

Denaturáció

A kétszálú DNS-templátot 94-96 °C-ra (vagy 98 °C-ra, ha különösen hőstabil polimerázt használunk) 0,5-2 percig melegítjük. , hogy a DNS-láncok szétszóródjanak. Ezt a lépést olvasztásnak ( denaturáció ) nevezik, mivel a két DNS-szál közötti hidrogénkötések megszakadnak. Általában az első ciklus előtt a reakcióelegyet hosszan 2-5 percig melegítik a templát és a primerek teljes denaturálásához.

Lágyítás

Amikor a szálakat szétválasztjuk, a hőmérsékletet lecsökkentjük, hogy lehetővé tegyük a primerek kötődését az egyszálú sablonhoz. Ezt a szakaszt lágyításnak nevezik . A lágyítási hőmérséklet az alapozók összetételétől függ, és általában 5 fokkal alacsonyabbra választják, mint a primerek olvadáspontja. A lágyítási hőmérséklet helytelen megválasztása vagy a primerek gyengén kötődik a templáthoz (emelt hőmérsékleten), vagy rossz helyen kötődik, és nem specifikus termékek jelennek meg (alacsony hőmérsékleten). Az izzítási szakasz ideje - 30 másodperc Ezzel egyidejűleg ez idő alatt a polimeráznak már van ideje több száz nukleotid szintetizálására. Ezért ajánlatos 60°C feletti olvadáspontú alapozót választani, és egyszerre, 60-72°C-on végezni a lágyítást és a nyújtást.

Megnyúlás

A DNS-polimeráz replikálja a templátszálat, a primert primerként használva. Ez a megnyúlás szakasza . A polimeráz a második szál szintézisét a primer 3' végétől kezdi meg, amely a templáthoz kötődött, és a templát mentén mozog, új szálat szintetizálva az 5'-től a 3'-végig. A nyúlási hőmérséklet a polimeráztól függ. Az általánosan használt Taq és Pfu polimerázok 72 °C-on a legaktívabbak. Az elongációs idő mind a DNS-polimeráz típusától, mind az amplifikálandó fragmens hosszától függ. A nyúlási időt jellemzően minden ezer bázispáronként egy percnek vesszük. Az összes ciklus lejárta után gyakran a végső megnyújtás egy további szakaszát hajtják végre az összes egyszálú fragmentum elkészítése érdekében. Ez a szakasz 7-10 percig tart.

Egy adott reakciótermék mennyisége (amelyet primerek korlátoznak) elméletileg 2n  - 2n arányban növekszik, ahol n a reakcióciklusok száma [17] . Valójában az egyes ciklusok hatásfoka 100%-nál kisebb is lehet, így a valóságban P ~ (1 + E) n , ahol P a termék mennyisége, E a ciklus átlagos hatásfoka.

A "hosszú" DNS-másolatok száma is nő, de lineárisan, így a reakciótermékekben egy specifikus fragmentum dominál.

A szükséges termék növekedését exponenciálisan korlátozza a reagensek mennyisége, az inhibitorok jelenléte és a melléktermékek képződése. A reakció utolsó ciklusaiban a növekedés lelassul, ezt nevezik "fennsík-effektusnak".

PCR variánsok

• Az RPA -t ( Recombinase Polymerase Amplification  – rekombináz polimeráz amplifikáció ) használják, ahol 15 percen belül DNS/RNS amplifikációra van szükség hőciklus nélkül (izoterm reakció) [18] [19] .
• Nested PCR  ( nested PCR ) – a reakció melléktermékeinek számának csökkentésére szolgál. Használjon két pár primert, és hajtson végre két egymást követő reakciót. A második primerpár amplifikálja az első reakció termékén belüli DNS-régiót.
• Invertált PCR  (inverz PCR) - akkor használatos, ha a kívánt szekvencián belül csak kis terület ismert. Ez a módszer különösen akkor hasznos, ha a szomszédos szekvenciák meghatározására van szükség a DNS-nek a genomba történő beillesztése után. Az invertált PCR végrehajtásáhozrestrikciós enzimekkel egy sor DNS-majd a fragmentumok összekapcsolását (ligálás) követik. Ennek eredményeként az ismert fragmensek az ismeretlen régió mindkét végén találhatók, ami után a PCR a szokásos módon elvégezhető.
• A reverz transzkripciós PCR ( RT-PCR ) egy ismert szekvencia RNS-könyvtárból történő amplifikálására, izolálására vagy azonosítására szolgál. A hagyományos PCR előtt egyszálú DNS-molekulát szintetizálnak az mRNS -templáton reversetas segítségévelés egy egyszálú cDNS -t kapnak , amelyet templátként használnak a PCR-hez. Ez a módszer gyakran meghatározza, hogyezek a gének hol és mikor fejeződnek ki .
• Aszimmetrikus PCR  (aszimmetrikus PCR) - akkor hajtják végre, ha az eredeti DNS egyik láncának amplifikálására van szükség. Egyesszekvenálásiéshibridizációselemzési technikákban használatos. A PCR-t a szokásos módon hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy az egyik primert nagy feleslegben vettük fel. Ennek a módszernek egy módosítása aLinearAfter - The - E xponential - PCR (LATE-PCR)magasabb (olvadáspontpárosulmint a magas koncentrációjú primerhez. A PCR-t magas illesztési hőmérsékleten hajtják végre, így a reakció hatékonyságát minden ciklusban fenntartják [20] .
• A kvantitatív PCR ( kvantitatív PCR, Q-PCR ) vagy a valós idejű PCR  ( valós idejű polimeráz láncreakció ) segítségével közvetlenül nyomon követhető egy adott PCR-termék mennyisége az egyes reakcióciklusokban. Ez a módszer fluoreszcensen jelölt DNS-próbákat használ a reakciótermék vagy az interkaláló SYBR Green festék (vagy analógjai) felhalmozódásának elemzésére. A Sybr Green I egyszerű és költséghatékony lehetőséget kínál a PCR-termékek valós idejű PCR-detektálására és mennyiségi meghatározására anélkül, hogy speciális fluoreszcens próbákra vagy primerekre lenne szükség. Az amplifikáció során a SYBR Green I festék beépül a PCR termékek DNS-ének kisebb barázdájába, és kék lézerrel besugározva erősebb fluoreszcens jelet bocsát ki, mint a kötetlen festék. A SYBR Green I kompatibilis az összes jelenleg ismert valós idejű PCR műszerrel. A SYBR Green I abszorpciós maximuma 494 nm hullámhosszon van. A fő mellett két további kis abszorpciós maximum van a festékspektrumban, 290 nm és 380 nm-en. A SYBR Green I maximális emissziója 521 nm (zöld) [21] .
• Stepped PCR (touchdown PCR) - ezzel a megközelítéssel a primerek nem specifikus kötődésének hatása csökken. Az első ciklusokat az optimális izzítási hőmérséklet feletti hőmérsékleten hajtjuk végre, majd néhány ciklusonként az izzítási hőmérsékletet fokozatosan az optimálisra csökkentjük. Ez annak biztosítására szolgál, hogy a primer hibridizálódjon a komplementer szálhoz annak teljes hosszában; míg az optimális összekapcsolási hőmérsékleten a primer részlegesen hibridizálódik a komplementer szálhoz. A primer részleges hibridizációja genomi DNS-en nem specifikus amplifikációhoz vezet, ha elegendő kötőhely van a primer számára. A legtöbb esetben a PCR első tíz ciklusát 72-75 °C-os hőkezelési hőmérsékleten lehet végrehajtani, majd azonnal az optimálisra, például 60-65 °C-ra csökkenteni.
• Molekuláris kolónia módszer (PCR gélben,telep PCR) -akrilamid gélt polimerizáljákaz összes PCR komponenssel a felületen, és PCR-t végeznek. Az elemzett DNS-t tartalmazó pontokon az amplifikáció molekuláris kolóniák képződésével történik.
• PCR a cDNS-végek gyors amplifikációjával (cDNS-végek gyors amplifikációja, RACE-PCR).
• A hosszú fragmensek PCR -je ( long-range PCR ) egy PCR-módosítás kiterjesztett DNS-szegmensek (10 ezer vagy több bázis) amplifikálására. Két polimeráz keverékét használjuk, amelyek közül az egyik egy nagy processzivitással rendelkező Taq polimeráz (azaz egy lépésben képes egy hosszú DNS-láncot szintetizálni), a másik pedig egy 3'-5'-exonukleáz aktivitással rendelkező DNS polimeráz. , általában Pfu polimeráz . A második polimeráz szükséges az első által bevezetett hibák kijavításához, mivel a Taq polimeráz leállítja a DNS szintézist, ha nem komplementer nukleotidot adnak hozzá. Ezt a nem komplementer nukleotidot a Pfu polimeráz távolítja el. A polimerázok keverékét 50:1 arányban, vagy akár 100:1-nél is kisebb arányban veszik fel, ahol a Taq polimerázokat 25-100-szor többen veszik fel, mint a Pfu polimerázokat.
• RAPD ( Random Amplification of Polymorphic DNA ), PCR a polimorf DNS véletlenszerű amplifikációjával – akkor használatos, ha különbséget kell tenni a genetikai szekvenciában közel álló organizmusok, például a kultúrnövények különböző fajtái, kutyafajták vagy szorosan. rokon mikroorganizmusok. Ez a módszer általában egyetlen kis primert használ (körülbelül 10 bp). Ez a primer részben komplementer lesz a vizsgált organizmusok véletlenszerű DNS-régióival. A feltételek megválasztásával (primer hossza, primer összetétele, hőmérséklet stb.) két organizmus PCR mintázatában kielégítő különbséget lehet elérni.
• Csoportspecifikus PCR ( csoportspecifikus PCR ) – PCR rokon szekvenciákhoz ugyanazon vagy különböző fajok között , ezekhez a szekvenciákhoz konzervatív primereket használva. Például a 18S és 26S riboszomális gének univerzális primereinek kiválasztása egy fajspecifikus intergénközi spacer amplifikálásához: a 18S és 26S gének szekvenciája konzervált a fajok között, így a PCR ezek között a gének között minden faj esetében megtörténik. tanulmányozás alatt. Ennek a módszernek az ellentéte az egyedi PCR ( united PCR ), ahol a feladat az, hogy olyan primereket válasszunk ki, amelyek csak egy szekvenciát amplifikálnak az összes kapcsolódó szekvenciából.
• A PCR hot start (hot start PCR) a PCR DNS-polimerázt használó módosítása, amelyben a polimeráz aktivitást szobahőmérsékleten blokkolják az antitestek vagy kis molekulák, amelyek olyan antitesteket szimulálnak, mint az Affibody , vagyis a polimeráz aktivitásának időpontjában. a reakció beállítása az első denaturálás előtt PCR-ben. Az első denaturálást jellemzően 95 °C-on 10 percig végezzük.
• A virtuális PCR ( in silico PCR , elektronikus PCR, e-PCR)egy elméleti polimeráz láncreakció számítógépes elemzésének matematikai módszere, amely primer szekvenciák (vagy DNS-próbák ) listáját használja a genom , kromoszóma , cDNS lehetséges DNS- amplifikációjának előrejelzésérevagy bármely más vizsgált DNS-régió.

Ha a templát nukleotidszekvenciája részben ismert vagy egyáltalán nem ismert, akkor degenerált primerek használhatók , amelyek szekvenciája olyan degenerált pozíciókat tartalmaz, amelyekben bármilyen bázis elhelyezhető. Például a primer szekvencia lehet: ...ATH... ahol H jelentése A, T vagy C.

A PCR alkalmazása

A PCR-t számos területen használják elemzésre és tudományos kísérletekre.

Kriminalistika

A PCR-t az úgynevezett „genetikai ujjlenyomatok” összehasonlítására használják. A tetthelyről származó genetikai anyag mintája szükséges – vér, nyál, sperma, haj stb. Ezt összehasonlítják a gyanúsított genetikai anyagával. Nagyon kis mennyiségű DNS elég, elméletileg - egy példány. A DNS-t fragmensekre vágjuk, majd PCR-rel amplifikáljuk. A fragmentumokat DNS-elektroforézissel választják el . A DNS-sávok elhelyezkedéséről kapott képet genetikai ujjlenyomatnak nevezzük .

Az apaság megállapítása

Bár a "genetikai ujjlenyomatok" egyediek, családi kötelékek még mindig létrehozhatók több ilyen ujjlenyomat készítésével. [≡] Ugyanez a módszer, kis módosítással, alkalmazható az élőlények közötti evolúciós kapcsolatok megállapítására.

Orvosi diagnosztika

A PCR lehetővé teszi az örökletes és vírusos betegségek diagnosztizálásának jelentős felgyorsítását és megkönnyítését . A kívánt gént PCR-rel amplifikálják megfelelő primerek alkalmazásával, majd szekvenálják a mutációk meghatározására . A vírusfertőzések a fertőzés után azonnal, hetekkel vagy hónapokkal ( az inkubációs időszak hosszától függően) a betegség tüneteinek megjelenése előtt észlelhetők .

Személyre szabott orvoslás

Néha a gyógyszerek mérgezőek vagy allergizálóak egyes betegek számára. Ennek oka részben a gyógyszerek és származékaik érzékenységének és anyagcseréjének egyéni különbségei. Ezeket a különbségeket genetikai szinten határozzák meg. Például az egyik betegnél egy bizonyos citokróm (az idegen anyagok metabolizmusáért felelős májfehérje) aktívabb lehet, egy másikban - kevésbé aktív. Annak megállapítására, hogy egy adott betegnek milyen citokrómja van, javasolt a gyógyszer alkalmazása előtt PCR analízis elvégzése. Ezt az elemzést előzetes genotipizálásnak ( prospektív genotipizálásnak ) nevezik.

Génklónozás

A génklónozás (nem tévesztendő össze az organizmusok klónozásával ) a gének izolálásának és a géntechnológiai manipulációk eredményeként egy adott gén termékének nagy mennyiségének kinyerésének folyamata. A PCR-t egy gén amplifikálására használják, amelyet azután egy vektorba  , egy olyan DNS-darabba inszertálnak, amely egy idegen gént visz át ugyanabba vagy egy másik, könnyen termeszthető szervezetbe. Vektorként például plazmidokat vagy virális DNS-t használunk. A gének idegen szervezetbe történő beillesztését általában e gén termékének - RNS-nek vagy leggyakrabban fehérjének - előállítására használják. Ily módon számos fehérjét nyernek ipari mennyiségben, hogy felhasználják a mezőgazdaságban, az orvostudományban stb.

DNS szekvenálás

A fluoreszcens jelöléssel vagy radioaktív izotóppal jelölt didezoxinukleotidokat alkalmazó szekvenálási módszerben a PCR szerves részét képezi, mivel a polimerizáció során a fluoreszcens vagy radioaktív jelöléssel jelölt nukleotidszármazékok beépülnek a DNS-láncba. Didezoxinukleotid hozzáadása a szintetizált szálhoz leállítja a szintézist, lehetővé téve a specifikus nukleotidok helyzetének meghatározását a gélben történő elválasztás után.

Mutagenezis

Jelenleg a PCR a mutagenezis (a DNS nukleotidszekvenciájának megváltoztatása) végrehajtásának fő módszere. A PCR alkalmazása lehetővé tette a mutagenezis eljárás egyszerűsítését, felgyorsítását, valamint megbízhatóbbá és reprodukálhatóbbá tételét.

Molekuláris sexing

A PCR gyakorlati alkalmazásának másik területe a molekuláris ivarmeghatározás  – a nemek meghatározása a hímek és nők közötti DNS-szintű nemi különbségek alapján [22] .

Lásd még

• Nicking enzim által közvetített amplifikáció
• Helikáz függő erősítés
• DNS
• Immun-PCR
• A DNS felhasználása a technológiában
• Következő generációs szekvenálási módszerek
• Szekvenálás
• RNS szekvenálás
• SlipChip technológia
• elektroforézis
• DNS elektroforézis
• FastPCR
• Valós idejű PCR

Jegyzetek

1. ↑ Kleppe, K. et al. (1971): Tanulmányok polinukleotidokról. évi XCVI. Javítja a rövid szintetikus DNS-ek replikációit a DNS polimerázok által katalizáltaként. In: J. Mol. Biol. bd. 56, S. 341-361. PMID 4927950
2. ↑ Bartlett, JMS; Stirling, D. A polimeráz láncreakció rövid története // PCR-protokollok  (határozatlan) . — 2. - 2003. - T. 226. - S. 3-6. — (Módszerek a molekuláris biológiában). — ISBN 1-59259-384-4 . - doi : 10.1385/1-59259-384-4:3 .
3. ↑ Mullis, Kary B. et al. „Eljárás nukleinsavszekvenciák amplifikálására, kimutatására és/vagy klónozására” 4 683 195 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom
4. ↑ Saiki RK, Scharf S., Faloona F., Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Science 1985. december 20.; 230 (4732): 1350-4; Béta-globin genomiális szekvenciák enzimatikus amplifikációja és restrikciós hely elemzése a sarlósejtes vérszegénység diagnosztizálására.
5. ↑ [ Kémiai Nobel-díjasok 1993  ] . Letöltve: 2007. augusztus 29. Az eredetiből archiválva : 2012. október 26..  (határozatlan) Kémiai Nobel-díjasok, 1993  (angol )
6. ↑ RK Saiki, DH Gelfand, S. Stoffel, SJ Scharf, R. Higuchi, GT Horn, KB Mullis, HA Erlich. DNS primer által irányított enzimatikus amplifikációja termostabil DNS-polimerázzal Archiválva : 2008. december 19., a Wayback Machine -nél . in: Tudomány . 239.1988, 487-491. ISSN 0036-8075 PMID 2448875
7. ↑ Kaledin A. S., Slyusarenko A. G., Gorodetsky S. I. // Biokémia. - 1980. - T. 45. - C. 644-651.
8. ↑ Alice Chien, David B. Edgar és John M. Trela. Dezoxiribonukleinsav polimeráz Extreme Thermophilic Thermus aquaticusból. Bakteriológiai folyóirat, szept. 1976, pp. 1550-1557.
9. ↑ A Roche egyezségi megállapodást hirdet a Promegával (downlink) . Letöltve: 2007. augusztus 29. Az eredetiből archiválva : 2008. október 6.. (határozatlan) 
10. ↑ 1 kbp ( angol  kilo bázispár ) - 1 ezer bázispár, a DNS hosszának mértékegysége
11. ↑ Venter J et al. (2001). Az emberi genom szekvenciája. Science 291 (5507): 1304-1351. PMID 11181995
12. ↑ {title} (downlink) . Letöltve: 2007. szeptember 1. Az eredetiből archiválva : 2007. szeptember 29.. (határozatlan) 
13. ↑ Annealing ( annealing ) - DNS fragmentumok hibridizációja
14. ↑ Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz. Oligonukleotidok olvadáspontja pcr körülmények között: Mg 2+ , dezoxinukleotid-trifoszfát és dimetil-szulfoxid koncentrációk legközelebbi szomszédos korrekciói az alternatív empirikus képletekkel összehasonlítva  //  Clinical Chemistry : Journal. - 2001. - Vol. 47 , sz. 11 . - P. 1956-1961 . Az eredetiből archiválva : 2012. szeptember 1.
15. ↑ Hajtű  - intramolekuláris önkomplementer szerkezet
16. ↑ Dimer  - intermolekuláris struktúrák, amelyeket egymással vagy önmagukkal kialakított primerek alkotnak
17. ↑ Calendar R. N., Sivolap Yu. M. Polimeráz láncreakció tetszőleges primerekkel  // Biopolimerek és sejt: folyóirat. - 1995. - T. 11 , 3-4 . - S. 55-65 . — ISSN 0233-7657 . (Orosz)
18. ↑ Rekombináz polimeráz amplifikáció (RPA) – az izoterm DNS/RNS amplifikáció, amely valóban működik. . Letöltve: 2017. szeptember 9. Az eredetiből archiválva : 2017. szeptember 9.. (határozatlan)
19. ↑ Videó angolul: Mi az a rekombináz polimeráz amplifikáció? — TwistDx archiválva : 2016. november 24., a Wayback Machine -nél
20. ↑ Pierce KE és Wangh LJ Lineáris exponenciális polimeráz láncreakció és rokon technológiák Valós idejű kimutatási stratégiák a gyors, megbízható diagnózishoz egyetlen sejtből  //  Methods Mol Med. : folyóirat. - 2007. - Vol. Módszerek a Molekuláris Medicinában™ . - 65-85 . o . — ISBN 978-1-58829-578-1 . - doi : 10.1007/978-1-59745-298-4_7 . — PMID 17876077 .
21. ↑ Fluoreszcencia SpectraViewer Fluoreszcencia SpectraViewer | Élettechnológiák . Hozzáférés dátuma: 2012. október 30. Az eredetiből archiválva : 2012. november 15. (határozatlan)
22. ↑ Romanov MN, Ellegren H., Dodgson JB (2001.01.13.). Polimeráz láncreakcióval erősített markerek a madarak nemének meghatározásához . Nemzetközi Növény- és Állatgenom IX. Konferencia (San Diego, 2001. január 13–17 . ) San Diego, CA, USA: Scherago International. p. 118.OCLC 899128222.  _ _ Absztrakt P229. Archiválva az eredetiből , ekkor: 2020-09-20 . Letöltve: 2020-10-26 . Elavult használt paraméter |deadlink=( súgó ) (Angol)

Irodalom

• Glick B., Pasternak J. Molekuláris biotechnológia. Alapelvek és alkalmazás. Per. angolról. - M .: Mir, 2002. - 589 p., ill. — ISBN 5-03-003328-9
• Patrushev L. I. Mesterséges genetikai rendszerek. - M .: Nauka, 2005. - 2 kötetben - ISBN 5-02-033278-X
• Shchelkunov S. N. Génsebészet . - Novoszibirszk: Sib. univ. kiadó, 2004. - 496 p.; beteg. — ISBN 5-94087-098-8
• Ahsen N, Wittwer CT, Schutz E 2001. Oligonukleotidok olvadási hőmérsékletei PCR-körülmények között: Mg 2+ , dezoxinukleotid-trifoszfát és dimetil-szulfoxid koncentrációk legközelebbi szomszédos korrekciói az Alternatív empirikus géppel való összehasonlítással 0 szeptember1, az Archi2 Szeptember1 Formula, az Archi2 Szeptember1 . Clin Chem , 47:1956-1961.
• Kalendar R, Lee D, Schulman AH 2011. Java webeszközök PCR-hez, in silico PCR-hez és oligonukleotid-összeállításhoz és elemzéshez . Genomics, 98(2): 137-144. http://primerdigital.com/tools/ Archiválva az eredetiből 2012. szeptember 16-án.

Linkek

• A PCR laboratórium tevékenysége. A munka megszervezése az I-II patogenitási csoportba tartozó mikroorganizmusokkal fertőzött anyagok PCR-vizsgálatai során. Archív másolat 2010. szeptember 29-én a Wayback Machine -nél .
• "Klasszikus és molekuláris biológia" webhely: PCR-hez kapcsolódó technikák archiválva 2007. június 8-án a Wayback Machine -nél

Szótárak és enciklopédiák	Nagy dán nagy kínai nagy kínai nagy kínai Nagy orosz a világ körül Britannica (online) Brockhaus Universalis Universalis
Bibliográfiai katalógusokban	BNF : 121493620 GND : 4256726-9 J9U : 987007546303405171 LCCN : sh89002539 NKC : ph907888