Az immun-PCR [1] ( eng. immuno-PCR ) egy szuperszenzitív módszer az antigének kimutatására az antitestekkel való specifikus kölcsönhatásaik alapján, és ennek a kölcsönhatásnak a polimeráz láncreakció (PCR) segítségével történő kimutatása. Az immun-PCR módszer sok tekintetben hasonlít az enzim- linked immunosorbent assay -hez (ELISA), de az antigén-antitest komplex kimutatására enzim helyett egy DNS-fragmenst használ , amelynek mennyisége a PCR során exponenciálisan növekszik. Ennek a DNS-fragmensnek a reakcióelegyben való amplifikációja a módszer analitikai jele [2] .
Az immun-PCR módszert 1992-ben javasolták. Aztán a Kaliforniai Egyetem tudósai a szarvasmarha szérumalbumin (BSA) kimutatására használták . Kísérletükben a kimutatási határ öt nagyságrenddel magasabb volt, mint a standard ELISA, mintánként 580 molekula [2] [3] .
Az immun-PCR módszer az ELISA és a PCR kombinációja . Ezek közül az elsőt akkor alkalmazzák, ha a klinikai diagnosztikában hormonokat , antitesteket , fehérjéket vagy toxinokat kell kimutatni . A különféle specifitású antitestek rendelkezésre állása miatt ez a módszer lehetővé teszi az antigének széles körének kimutatását . Az ELISA érzékenysége azonban viszonylag alacsony. Másrészt a széles körben alkalmazott PCR módszer nagyon kis mennyiségű DNS kimutatására szolgál. Elméletileg a vizsgált mintában lévő kimutatható DNS egy példánya is elegendő a vírusos és bakteriális betegségek vagy az örökletes betegségek diagnosztizálásához. Az immun-PCR lényege, hogy továbbra is detektáljon különféle antigéneket specifikus antitestekkel, de pozitív jelet kapjon erről a kimutatásról nem egy enzim segítségével, mint az ELISA-ban, hanem egy DNS-tag segítségével, mint pl. PCR [4] .
Az immun-PCR első szakaszában immunkémiai reakció megy végbe a mintában lévő elemzett vegyület és az antitest között. Az ELISA-val analóg módon különféle módokon valósítják meg. A direkt változatban (1. ábra, A) a meghatározandó antigént tartalmazó mintát felvisszük a lemez felületére, majd DNS-sel jelölt specifikus antitesttel közvetlenül meghatározzuk az antigént. Ha nem áll rendelkezésre DNS-címkével ellátott specifikus antitest, akkor azt egy másodlagos (fajellenes) DNS-hez kötött antitest határozza meg. Az ilyen formátumot indirektnek nevezzük (1. ábra, B). A mátrixokban ( vérszérum , plazma ) lévő antigén meghatározásához "szendvicset" használunk (1. ábra, C). Ehhez előzetesen rögzítik a kötő antitesteket a tabletta felületén, amelyek megkötik az antigént, amikor a mintát a lyukba visszük. A szendvics indirekt változata is lehetséges (2. ábra, D) [5] [6] .
A kis molekulatömegű anyagok meghatározására kompetitív formátumot használnak. Ebben az esetben a detektáló jelölt antitest nemcsak a vizsgált mintában lévő antigénnel lép kölcsönhatásba, hanem a szilárd fázison immobilizált antigénnel is. Minél több antigén van a mintában, annál több antigén-antitest komplex képződik az oldatban. Következésképpen kevesebb antitest kötődik a szilárd fázishoz, és a vizsgálat alacsonyabb jelet ad [5] .
Bizonyos esetekben antitestek helyett aptamerek is használhatók az antigének kimutatására . Például az R18 RNS aptamer specifikusan kötődik a nyúl IgG -hez . Ezt a módosulást immun-aptamer PCR-nek nevezik [7] .
A második szakaszban, amikor az antigén az antitest és a DNS-tag konjugátumához kötődik, polimeráz láncreakció megy végbe, amelynek eredményeként a DNS mennyisége a keverékben exponenciálisan növekszik. Az első kísérletekben az amplifikációs termékeket agaróz gélelektroforézissel elemeztük , de ehhez a reakcióelegyeket a gélre kellett átvinni, és az eredmények kvalitatívak vagy szemikvantitatívak voltak. Az elektroforézis alternatívájaként a valós idejű PCR-t (RT-PCR) javasolták: ezzel a módszerrel nemcsak a DNS-címke jelenlétét, hanem annak mennyiségét is megállapíthatja. A valós idejű PCR végrehajtásakor interkaláló festéket (például SYBR Green I ) vagy TaqMan próbát adnak a keverékhez, és a DNS mennyiségét a fluoreszcencia intenzitása határozza meg . Az amplifikációs szakasz végrehajtható ugyanabban a csőben, mint az immunkémiai reakció, vagy a DNS-jelölés átvihető egy másik csőbe. A második esetben először restrikázok segítségével vagy 95-100 °C-ra melegítéssel le kell hasítani . Ugyanakkor meg kell jegyezni, hogy az egy kémcsőben végzett elemzés lényegesen kevésbé érzékeny [7] [8] .
Elméletileg a pozitív jel eléréséhez elegendő, ha a DNS-jelölés egy példánya jelen van a reakcióelegyben. Valójában a módszer érzékenysége csökken az antigén és az antitest kölcsönhatásán alapuló szakaszok miatt. Úgy gondolom, hogy az immunkémiai módszerek kimutatási határa általában körülbelül 1000 analit molekula 100 μl keverékben. A sok publikációban ismertetett immun-PCR technikák érzékenységét közel ehhez a kimutatási határhoz, de még ennél is alacsonyabbat mutatnak. Ha feltételezzük, hogy egy tipikus fehérje tömege 50-100 kDa, akkor az immun-PCR kimutatási határának újraszámítása az analit pikogrammának megfelelő tömeget ad. Ez az érzékenység elegendő a szervezetben alacsony koncentrációban jelenlévő biomarkerek kimutatására [9] .
Az analízis platformja, akárcsak az ELISA vagy a PCR esetében, egy 96 lyukú mikrotiterlemez , amelynek képesnek kell lennie az antigének megkötésére, és hőállónak kell lennie, hogy a PCR közvetlenül elvégezhető legyen benne anélkül, hogy a reakcióelegyet átvinnék. egy másik tányért. Gyakoriak a megnövelt kötési kapacitású, kifejezetten immun-PCR-hez tervezett TopYield polikarbonát 8-lyukú csíkok is. (Bár a kutak alakjával kapcsolatban vannak hátrányok is: a PCR során egyenetlen hőeloszlás, valamint a fénytörési és visszaverődési zónák megjelenése, ami megnehezíti a PCR-görbék elemzését.) Immun-PCR-t Corning Costarban is végeznek. 6511 polikarbonát lemezek és Greiner Thermoquick 651570 polikarbonát lemezek, valamint Robostrips tablettákban [10] .
A DNS-fragmenssel jelölt antitest kulcsfontosságú eleme az immun-PCR végrehajtásának. A módszer érzékenysége és reprodukálhatósága a konjugátum szerkezetétől függ. Az antitest és a DNS közötti kapcsolat természete szerint az ilyen konjugátumoknak három fő típusát különböztetjük meg: kiméra fehérjéket, biotin-sztreptavidin konjugátumokat és kovalens konjugátumokat [11] .
Kezdetben egy speciális kiméra fehérjét használtak az immun-PCR-ben, amely egy protein A fragmentumot és egy sztreptavidin fragmentumot tartalmazott . A protein A egy fragmense megkötötte az antitestet, a sztreptavidin pedig egy biotinmódosítással kötött DNS-t (2a. ábra). Ennek a konjugátumnak két hátránya van. Először is, a kiméra fehérjék szintézise önmagában időigényes. Másodszor, a protein A nemcsak affinitást mutat a meghatározott antitesthez, hanem nem specifikusan kölcsönhatásba lép a kötő antitestekkel is, amelyeket az immun-PCR "szendvics" formátumban történő beállításakor használnak. Emiatt háttérjel jelenik meg, és a módszer érzékenysége csökken [2] [4] .
A gyakorlatban egyszerűbbnek bizonyult a biotin és a sztreptavidin kölcsönhatásán alapuló konjugátum létrehozása (2. ábra, B) [12] . Ismeretes, hogy a tetramer fehérjék, az avidin (természetes) és a streptavidin ( a Streptomyces avidii tenyészetéből génmanipulált ) nagyon stabil komplexet alkotnak a biotinnal (disszociációs állandó 10-13-10-15 ) . A biotint kémiai úton juttatják be a konjugált molekulákba - antitestbe és DNS-be, majd ezeket a molekulákat összekeverik sztreptavidinnel (előnyösebb, mert az avidinnel ellentétben nem tartalmaz szénhidrát-fragmenseket, amelyek nem specifikus kölcsönhatásokhoz vezetnek), így konjugátum jön létre [2] [ 13 ] .
Ez a megközelítés nem teljesen optimális, mivel az avidin vagy a streptavidin tetravalenciája miatt a kapott konjugátumok változó összetételűek lehetnek, ami befolyásolja a kísérlet reprodukálhatóságát [14] . Az ilyen komplexek önképződésének későbbi vizsgálatai azonban azt mutatták, hogy a sztreptavidin, négyértékű természete ellenére, hajlamos túlnyomórészt két biotinilált DNS-molekulához kapcsolódni, és négy DNS-molekulával konjugátum egyáltalán nem képződik [15] . A szükséges reagensek kereskedelmi elérhetősége ezt a megközelítést "univerzális immun-PCR protokolllá" változtatta [16] , amely nagyon népszerűvé vált [17] .
A biokonjugációs módszerek kifejlesztésének köszönhetően lehetővé vált az antitestek kovalens konjugátumainak DNS-sel történő kémiai szintézise bifunkciós térhálósítók segítségével (2. ábra, C). Erre a célra számos reagens kapható a piacon. A konjugációt általában a DNS vagy antitestek aminocsoportjainak vagy tiolcsoportjainak kémiai módosításával hajtják végre. A kattintási kémiai reakciókhoz kapcsolódó megközelítések is fejlesztés alatt állnak . Másrészt a tudományos irodalom elégtelen vagy ellentmondó adatot közöl az ilyen konjugátumok hozamáról és tisztítási módszereiről [2] [18] .
Mivel kovalens konjugátumokban a detektáló antitest és a DNS-toldalék egyedi módon kapcsolódnak egymáshoz (míg a biotin-sztreptavidin konjugátumok egyensúlyi komplexek), ez lehetővé teszi több antigén meghatározását egy mintában. Az egyik első ilyen analízist három analiten végezték el, különböző hosszúságú DNS-címkék felhasználásával [19] . Az interleukin 6 meghatározása során különböző megközelítéseket hasonlítottak össze, és kimutatták, hogy kovalens konjugátumok használata 100-szoros érzékenységnövekedést eredményez a lépcsőzetes protokollhoz képest [20] .
Az immun-PCR kifejlesztésének fő szakaszai: [21]
Az antigén „kettős felismerésével” sikerült növelni az immun-PCR érzékenységét. A proximális próba ligálási módszer a meghatározandó antigén két szomszédos epitópjára specifikus két antitest alkalmazásán alapul . Ezen antitestek DNS-címkéi nukleotidszekvenciában különböznek, de kis komplementer régiókkal rendelkeznek. Amikor mindkét antitest kölcsönhatásba lép egy antigénnel, DNS-jeleik közelednek egymáshoz a térben, majd a ligáz enzim hatására egyesülnek . Ez egy új DNS-szálat hoz létre, amely amplifikáción megy keresztül. Mivel pozitív szignál csak akkor lehetséges, ha az antigént egyszerre két antitest ismeri fel, ez a séma lehetővé teszi a nem specifikus kötődés kizárását [22] .
Az immun-PCR lehetőségei kibővülnek a különböző nanostruktúrák elemzésben történő felhasználása miatt. Például javasolták mágneses vagy arany nanorészecskék használatát antitesthordozóként . Használatuk megkönnyíti a szükséges manipulációk elvégzését és csökkenti a minta idegen komponenseinek befolyását. Mindkét nanorészecskét felhasználják a biovonalkód vizsgálatban : a mágneses nanorészecskék kötő antitesteket, míg az arany nanorészecskék detektáló antitesteket és DNS-címkét tartalmaznak. Az analízist szendvics formátumban végzik, majd az immunkomplexeket mágnessel összegyűjtik, és az arany nanorészecskékből a DNS-t hasítják le további elemzés céljából. A "biobarcoding" elnevezés annak a ténynek köszönhető, hogy az eredeti publikáció szkenometrikus elemzési módszert javasolt. Így a hasított DNS-t egy üvegfelülethez konjugáltuk, amelyen előzőleg a DNS-lánc felével komplementer oligonukleotidokat rögzítettünk. Ezután ezüst(I)-vel bevont arany nanorészecskéket adtunk hozzá, amelyek a DNS-tag második felével komplementer oligonukleotidokat tartalmaztak. Aztán az ezüstöt helyreállították. Ha DNS-címke („vonalkód”) volt a rendszerben, a rendszer pozitív jelet adott. Ennek a módszernek a kilátásai több analit egyidejű meghatározásának lehetőségével függnek össze, mivel a nanorészecskéket egyedi oligonukleotid szekvenciájú oligonukleotidok „kódolhatják” [23] [24] .
A módszer érdekes fejlesztése az úgynevezett "tadpoles" ( eng. ebihalak ) alkalmazása. Ezek speciális konjugátumok, amelyekben a fehérje "fej" a DNS farkához kapcsolódik. Az ilyen konjugátumok fehérje része egy hisztidin címkét tartalmaz, amely felismeri a célantigént, az inteint és a kitinkötő domént . A fehérjét kitintartalmú oszlopokon tisztították, az inteint immobilizált állapotban kimetsszük, és egy cisztein -maradékot tartalmazó oligonukleotidot kapcsoltak hozzá [25] [26] .
Léteznek vírusrészecskéket, liposzómákat és fágmegjelenítést alkalmazó immun-PCR-rendszerek is [27] .
2010 - ben javasolták a Tus-Ter zár alapú konjugátumok használatát . A tus egy fehérje, amely leállítja a replikációs folyamatot; szorosan kötődik a rövid Ter nukleotid szekvenciákhoz. A Tus-Ter komplexet egy DNS-tag és egy antitest sztöchiometrikus és helyspecifikus kötésére használták [28] .
2015-től az immun-PCR módszer kereskedelmi forgalomba került: az analitikai rendszerek létrehozására irányuló szolgáltatásokat, beleértve azokat is, amelyek megfelelnek a GLP -szabványoknak , szerződéses kutatószervezetek és bioanalitikai szolgáltatások nyújtják [29] .
Különböző kutatócsoportok alkalmazták az immun-PCR módszert fontos fehérjék és kis molekulájú vegyületek kimutatására. Ugyanakkor sok ilyen kísérletet magának a módszernek a lehetőségeinek tanulmányozására, a különböző formátumok és típusú konjugátumok összehasonlítására, valamint az érzékenységi határok meghatározására használtak. E vizsgálatok adatait áttekintések rendszerezték [30] [31] , az alábbiakban pedig a kimutatott analitok osztályaira vonatkozó főbb eredményeket közöljük.
Az immun-PCR leggyakoribb antigének a tumorokhoz kapcsolódó markerfehérjék, amelyek fejlődésük korai szakaszában nagyon alacsony koncentrációban vannak jelen. Ezek közül a legfontosabbak a rákos embrionális antigén (CEA) és a prosztata specifikus antigén (PSA). Egy tanulmányban az immun-PCR módszer körülbelül 1000-szer érzékenyebb a CEA-ra, mint az ELISA [32] , majd később a CEA-érzékenységet 13 fg/ml-re növelték, ami 1500-szor magasabb, mint a klinikai érzékenység. módszerek [33] .
A PSA analitként szolgált három immun-PCR formátum teszteléséhez, amelyek közül a legérzékenyebb a kovalens antitest-DNS konjugátumot használó formátum (a kimutatási határ 48·10 5 molekula volt) [34] . Egy mágneses nanorészecskéken alapuló rendszer lehetővé tette 0,1 pM PSA meghatározását, ami 1000-szer érzékenyebb, mint az ELISA [35] .
Az immun-PCR-t a vírusfehérjék meghatározására használják, mivel a korai stádiumban nagyon kis számú virion van jelen a szervezetben , és csak nagyon érzékeny módszerekkel határozható meg. Ennek a típusnak az egyik népszerű antigénje a hepatitis B vírus markere, a HBsAg : több csoport munkája eredményeként ennek az antigénnek a kimutatási határát immun-PCR-rel reakciónként 15 fg-ra csökkentették, az érzékenységben pedig az ELISA-hoz képest 2000-szeres volt . 36] . Ezenkívül az immun-PCR 10 ng HBcAg -t képes kimutatni, amely egy másik fehérje, amely a hepatitis B vírus jelenlétéhez kapcsolódik a szervezetben [37] .
A p24 antigén a HIV-1 vírus kapszidjának összetevője , és segít a vírus korai stádiumban történő azonosításában. Különböző kísérletekben az immun-PCR segítségével ennek az antigénnek 1000 és 4600 molekuláját sikerült kimutatni [38] . A Hantaan vírust általában nukleokapszid fehérje immunoassay módszerekkel mutatják ki. A fágmegjelenítést alkalmazó immun-PCR 10 pg/ml fehérje kimutatását tette lehetővé, és arany nanorészecskék alkalmazásakor az érzékenység 10 fg/ml-re nőtt, ami hét nagyságrenddel jobb, mint az ELISA esetében [39]. . A H5N1 madárinfluenza vírus vizsgálatában az immun-PCR szintén 1000-szeres, illetve 100-szor jobb az ELISA-nál és a valós idejű PCR- nél [40] [41] .
Az adenovírusokat immun-PCR-rel is meghatározzák , és ez a módszer előnyt jelent a PCR-rel szemben, mivel a PCR-hez szükséges a DNS izolálása a mintából, az immun-PCR módszernél pedig a mosási szakaszban történik a tisztítás az idegen komponensektől. Az immun-PCR rotavírusokkal szembeni érzékenysége az irodalmi adatok szerint egybeesik a PCR érzékenységével. Az immun-PCR módszer a norovírusok kimutatására is alkalmas [42] .
Az immun-PCR-t a kórokozók kimutatására is használják. Például a Staphylococcus aureus számos enzimje, fehérje és toxinja alapján azonosítható, ezek közül a legjelentősebb a protein A és a B típusú enterotoxin . Az elsőt immun-PCR-rel határozták meg 1· 10-17 g/ml koncentrációban, a másodikhoz pedig olyan rendszereket fejlesztettek ki, amelyek lehetővé teszik mind tisztatenyészetekben, mind élelmiszermintákban [43] [44 ] ] . Leírtak egy módszert a Borrelia burgdorferi baktérium, a Lyme-kór kórokozójának kimutatására e baktérium elleni specifikus IgG és IgM antitestek segítségével [45] [46] .
Leírnak példákat bakteriális, növényi és mikotoxinok meghatározására is . Például a botulinum toxint ionmentesített vízben körülbelül 12 molekula/ml (0,02 fg/ml) koncentrációban mutatták ki. Egy másik kísérletben az A toxoidot 90 pg/ml koncentrációban határozták meg. A toxinokat a tejben is meghatároztuk (3,75 pg/ml A típusú botulinum toxin, 750 pg/ml B típusú botulinum toxoid, 0,1 pg/ml Shiga toxin 2). A ricint 10-100 pg/ml koncentrációban találták az élelmiszerekben. Az aflatoxin és a poliklórozott bifenilek meghatározására vonatkozóan is publikáltak adatokat [47] .
Egyes betegségek és rendellenességek diagnosztizálása nem külső antigének, hanem magának a szervezetnek az összetevőinek, például enzimeknek , kis molekulatömegű vegyületeknek és ionoknak a kimutatásán alapul. Bizonyos esetekben az immun-PCR módszer alkalmazható erre a célra. Így a tumor nekrózis faktort 1 fg/ml koncentrációig találták (50 000-szer érzékenyebb, mint az ELISA). Az alkalikus foszfatázt specifikus IgG antitesttel mutatták ki 10-11 U mennyiségben [48] .
Egyes antigének genetikai rendellenességek és idegrendszeri betegségek kialakulásához kapcsolódnak. Az immun-PCR nagy érzékenysége lehetővé teszi a prionok nagyon alacsony koncentrációinak kimutatását az agyszövet és a cerebrospinális folyadék nehezen beszerezhető mintáiban . Olyan technikát javasoltak, amely lehetővé teszi, hogy immun-PCR-rel egyidejűleg három, az idegrendszerhez kapcsolódó fő fehérjét határozzunk meg: a priont, a neuronspecifikus enolázt és a gliafibrilláris savas fehérjét [48] .
Az idegrendszeri rendellenességek fontos markerei a tau fehérjék : a hibás tau fehérjék ( e fehérjék epitópjainál vagy izoformáinál foszforilálva ) rosszul stabilizálják a mikrotubulusokat , ami patológiákat okoz. Az immun-PCR lehetővé teszi a tau fehérjék hibás izoformáinak kimutatását 2-10 pg/ml koncentrációban. A béta-amiloidot , az Alzheimer-kór egyik kiváltóját 2 amol/l koncentrációban mutatták ki [48] .
A Fabry-kór az alfa-galaktozidáz A gén hibáihoz kapcsolódik . Általában ezt a fehérjét ELISA-val határozzák meg, de az immun-PCR 25-szörösére növeli az érzékenységet [49] .
Az immun-PCR módszer nagyon érzékeny, ezért kritikus szerepet játszik benne a háttérjel, amely megzavarhatja a pozitív eredmény megfigyelését. Ennek oka a reakcióelegy komponenseinek nem specifikus kötődése, vagy a szabad DNS nyomokban való jelenléte az antitest-DNS konjugátumban. Egyetlen DNS-ek még a negatív kontroll mintákban is megjelennek, jelenlétük szinte mindig a 30-40. PCR ciklusban jelenik meg. Az immun-PCR optimalizálása (mosóoldatok kiválasztása, mosás időtartamának növelése, nukleázok alkalmazása ) lehetővé teszi a háttérjel és a jel közötti maximális különbség elérését a kémcsövekben az antigén jelenlétének meghatározásával. Az immun-PCR érzékenységének van egy másik hátulütője is: a meghatározás minősége romlik a reakcióelegyek keresztszennyeződésének vagy a környezetből származó szennyeződésnek a lehetősége miatt. Ennek elkerülésére térben elválasztják az immunkémiai munka és a PCR helyszínét [50] [51] .
Az immun-PCR munkaigényes módszer: az elemzés körülbelül 20 mosási lépésből áll, és a teljes elemzés 26 órától 2 napig tart. Az analízis ideje csökkenthető az antitest-DNS konjugátumok előzetes elkészítésével. Ellenkező esetben az elemzés során elő kell őket készíteni; míg az inkubációs és mosási szakaszok száma növekszik [52] .