Fluoreszcens in situ hibridizáció

A fluoreszcencia in situ hibridizáció vagy FISH-módszer ( fluoreszcencia in situ hibridizáció – FISH ) egy citogenetikai  módszer , amelyet egy adott DNS-szekvencia detektálására és helyzetének meghatározására használnak metafázisú kromoszómákon vagy in situ fázisú magokban . Ezenkívül a FISH-t specifikus mRNS -ek kimutatására használják szövetmintában . Ez utóbbi esetben a FISH-módszer lehetővé teszi a sejtekben és szövetekben a génexpresszió spatiotemporális jellemzőinek megállapítását.

A FISH módszert preimplantációs , prenatális és posztnatális genetikai diagnosztikában [1] , onkológiai betegségek diagnosztikájában [2] , retrospektív biológiai dozimetriában [3] alkalmazzák .

Probes

Az in situ fluoreszcens hibridizáció DNS-próbákat (DNS-próbákat) használ , amelyek a mintában lévő komplementer célpontokhoz kötődnek . A DNS-próbák fluoroforokkal jelölt nukleozidokat (közvetlen jelölés) vagy konjugátumokat, például biotint vagy digoxigenint (közvetett jelölés) tartalmaznak. Közvetlen jelöléssel a célponthoz kötött DNS-próba fluoreszcens mikroszkóppal közvetlenül a hibridizáció befejezése után megfigyelhető . Közvetett jelölés esetén további festési eljárásra van szükség, melynek során a biotin kimutatása fluoreszcensen jelölt avidin vagy sztreptavidin, a digoxigenin pedig fluoreszcensen jelölt antitestek segítségével történik . Bár a DNS-próbajelölés indirekt változata további reagenseket és időköltségeket igényel, ez a módszer általában magasabb jelszint elérését teszi lehetővé, mivel 3-4 fluorokróm molekula van egy antitesten vagy avidin molekulán. Ezen kívül indirekt címkézés esetén lehetséges a jel kaszkádos erősítése [4] .

A DNS-próbák létrehozásához klónozott DNS-szekvenciákat használnak (például a 3. humán kromoszóma Noi I-kötő klónjait , BAC klónokat) [5] [6] , genomi DNS-t, PCR - termékeket , jelölt oligonukleotidokat , valamint Mikrodisszekcióval nyert DNS [4] .

A próba jelölése többféle módon is végrehajtható, például nick-transzlációval vagy jelölt nukleotidokkal végzett PCR-rel .

Hibridizációs eljárás

Az első lépés a szondák tervezése. A próba méretének elég nagynak kell lennie ahhoz, hogy a hibridizáció egy adott helyen végbemenjen, de ne legyen túl nagy (legfeljebb 1 kb), hogy ne zavarja a hibridizációs folyamatot. Specifikus lókuszok azonosításakor vagy teljes kromoszómák festésekor meg kell akadályozni a DNS-próbák hibridizációját nem egyedi ismétlődő DNS-szekvenciákkal úgy, hogy jelöletlen DNS-ismétlődéseket (például Cot-1 DNS-t ) adunk a hibridizációs keverékhez. Ha a DNS próba kettős szálú DNS, akkor azt denaturálni kell a hibridizáció előtt.

A következő szakaszban interfázisú magok vagy metafázisú kromoszómák preparátumait készítik elő. A sejteket egy szubsztrátumon, általában egy tárgylemezen rögzítik, majd DNS-denaturációt végeznek . A kromoszómák vagy magok morfológiájának megőrzése érdekében a denaturálást formamid jelenlétében végezzük , ami lehetővé teszi a denaturációs hőmérséklet 70 °C-ra csökkentését.

Ezután próbákat adunk a készítményhez, és körülbelül 12 órán keresztül hibridizáljuk. Ezután végezzen több mosási fázist, hogy eltávolítsa az összes nem hibridizált szondát.

A megkötött DNS-próbák megjelenítését fluoreszcens mikroszkóp segítségével végezzük. A fluoreszcens jel intenzitása számos tényezőtől függ – a szonda jelölési hatékonyságától, a szonda típusától és a fluoreszcens festék típusától.

Lásd még

RGEN-ISL Molekuláris képalkotó módszer RNS-irányított CRISPR/dCas9 endonukleázzal, amely címkével van társítva. A klasszikus fluoreszcens in situ hibridizációtól eltérően az RGEN-ISL nem igényel DNS-denaturációt, ezért jobb megőrzést biztosít a kromatin szerkezetében.

Jegyzetek

1. ↑ Shilova N. V., Zolotukhina T. V. Interfázisú fluoreszcens in situ hibridizáció a numerikus kromoszóma-rendellenességek diagnosztizálásában // Orvosi genetika. - 2007. - T. 6. - 10. sz. - S. 53-58.
2. ↑ Bridge JA, Cushman-Vokoun AM . Lágyszöveti daganatok molekuláris diagnosztikája  (neopr.)  // Archives of Pathology & Laboratory Medicine . - 2011. - május ( 135. évf. , 5. szám ). - S. 588-601 . - doi : 10.1043/2010-0594-RAIR.1 . — PMID 21526957 .
3. ↑ Ainsbury EA, Bakhanova E., Barquinero JF et al. A külső ionizáló sugárzás expozíciójának retrospektív dozimetriai technikáinak áttekintése  // Radiation Protection Dosimetry  : Journal  . - 2011. - november ( 147. évf. , 4. sz.). - P. 573-592 . doi : 10.1093 / rpd/ncq499 . — PMID 21183550 . Az eredetiből archiválva: 2015. november 20.
4. ↑ 1 2 Rubtsov N. B. Az emlős kromoszómákkal végzett munka módszerei: Proc. juttatás . - Novoszibirszk : Novoszib . állapot un-t , 2006. - 152 p. — ISBN 5-94356-376-8 . Archiválva : 2015. április 2. a Wayback Machine -nél
5. ↑ Sazanov AA, Sazanova AL, Stekol'nikova VA, Kozyreva AA, Romanov MN, Malewski T., Smirnov AF Hét HSA3q13→q23 NotI linking klón kromoszómális lokalizációja csirke mikrokromoszómákon: GGA14 és GGA15 ortológiája egy génben gazdag régióhoz HSA3  (angol)  // Citogenetikai és genomkutatás : magazin. - Basel , Svájc : Karger Publishers , 2005. - Vol. 111. sz. 2 . - P. 128-133. — ISSN 1424-8581 . - doi : 10.1159/000086381 . — PMID 16103653 . Az eredetiből archiválva: 2015. március 15.  (Hozzáférés: 2015. március 15.)
6. ↑ Sazanov AA, Romanov MN, Sazanova AL, Korczak M., Stekol'nikova VA, Kozyreva AA, Smirnov AF, Jaszczak K., Dodgson JB Chromosomal localization of 15 large inszert BAC clones among three microsatellites on chicken chromosome 4 which (GGA4) finomítani a centromer helyzetét  // Animal Genetics  : Journal  . - Oxford , Egyesült Királyság : International Society for Animal Genetics; Blackwell Publishers Ltd , 2005. évf. 36. sz. 2 . - P. 161-163. — ISSN 0268-9146 . - doi : 10.1111/j.1365-2052.2004.01225.x . — PMID 15771730 . Archiválva az eredetiből 2015. április 2-án.  (Hozzáférés: 2015. március 15.)

Irodalom

• Rubtsov N.B. Nukleinsavak in situ hibridizációja a kromoszóma-rendellenességek elemzésében // Molekuláris genetikai módszerek az örökletes és onkológiai betegségek diagnosztizálásában. Bevezetés a molekuláris diagnosztikába / Szerk. M. A. Paltseva, D. V. Zaletaeva. - M .: Orvostudomány , 2011. - T. 2. - S. 100-136. - 1000 példányban.  - ISBN 978-5-225-03557-0 .

Szótárak és enciklopédiák	nagy kínai nagy kínai Britannica (online)