Immunfluoreszcens analízis ( MFA - fluoreszcens antitestek módszere , immunfluoreszcencia ) ( eng. Immunofluorescence ) - immunológiai módszerek összessége felszíni és intracelluláris antigének kvalitatív és kvantitatív meghatározásárasejtszuszpenziók mintáiban (sejtkultúrák, baktériumok, mikoplazmák, rickettsia, vírusok), vérmintákban, csontvelőben, alveoláris lemosásokban, vékony szövetmetszetekben. A módszer lehetővé teszi a biológiai minták részletes elemzését bizonyos kórokozókra vagy betegségekre jellemző antigéndeterminánsok jelenlétére, mind a felszíni, mind az intracelluláris fehérjék és receptorok mennyiségi meghatározására. A vizsgálat és értékelés elvégezhető manuálisan fluoreszcens mikroszkóp segítségével, vagy automatizáltan áramlási citométer ( áramlási citométer ) vagy mikrochip citométer (chip citométer ) segítségével.). Konfokális mikroszkóp és robot fluoreszcens mikroszkóp (beleértve az áramlási citométerrel kombináltakat is) szoftveres képfeldolgozó rendszerrel kombinálva használható. A jelenleg rendelkezésre álló automatizált technológiák lehetővé teszik körülbelül 50 különböző antigén elemzését egy mintában, különféle fluoreszcens markerek segítségével, rendkívül informatív mikroszkópos és citometriás formátumban (a módszereket magas tartalmú képalkotásnak , nagy tartalmú citometriának , nagy tartalmú citometriának nevezik). szűrés ) és a modern áramlási citometria vagy konfokális mikroszkópia segítségével feleannyi antigénkészlet. A fő gyakorlati alkalmazások az onkológia, mikrobiológia, sejtbiológia, genetika, farmakológia stb.
A módszer lényege az antigén fluoreszcens markerekkel ellátott, specifikus antitestek általi megjelenítése. A globulinok szerves fluorokrómokkal való konjugálásának módszerét A. Koons dolgozta ki 1942-ben.. [1] Jelenleg a módszer különböző antigének elleni antitesteket és DNS- (pl. DAPI ), RNS- (pl. Sybr Green II ), lipidek és fehérjék specifikus festéseit egyaránt alkalmazza.
Az alapvető MFA technikában különbséget tesznek az A. Koons és Melvin Kaplan által kidolgozott direkt módszer [2] és az A. Koons és Wheeler által kidolgozott indirekt módszer között az indirekt MFA komplementerrel eredeti változatában .
A közvetlen módszernél ( pMPA ) fluoreszcens festékkel közvetlenül jelölt antitestek oldatát visszük fel a tesztkészítményre vagy sejtszuszpenzióra. Az antigén-antitest komplex képződését különböző intenzitású és tisztaságú fény formájában fluoreszcens jel mutatja.
Az indirekt módszerrel ( nMFA ) a kívánt antigének elleni antitesteket (ún. „első” antitesteket), majd az „első” antitestek ellen fajspecifikus „második” antitesteket viszünk fel a készítményre, amivel elkerülhető a nem specifikus reakció. Ebben az esetben csak a második antitest van konjugálva fluoreszcens festékkel. Például, ha a vizsgálatban az egér antitesteket, az egér IgG-t használjuk „első” antitestként, akkor a „második” antitestként fluoreszcens festékkel konjugált anti-egér IgG-t használunk. Az antigén-antitest komplex csak a "második" antitesthez való kötődés után hoz létre fluoreszcens festést.
A közvetett módszerekhez csak fluorokrómokat tartalmazó antiglobulin típusú szérumok szükségesek, de nagyszámú vizsgálati kontroll szükséges. A közvetlen módszerrel történő beállításnál csak egy kontrollt készítünk, bár a módszer korábbi verzióiban sok monospecifikus szérumra volt szükség. A direkt típusú MFA hátrányai hosszú ideig a korlátozott érzékenység volt az antigén összetételben hasonló objektumok közötti lehetséges keresztreakciók jelenléte és a fluoreszcens globulinok a készítmény különböző elemein történő adszorpciója miatti nem specifikus fluoreszcenciája miatt. Jelenleg használt kereskedelmi standard konjugátumok, amelyek immunglobulinokat tartalmaznak a vizsgált antigénekhez. A biomérnöki úton előállított immunglobulinok alkalmazása és a magas fokú antitesttisztítás lehetővé tette a nem specifikus reakciók gyakorlatilag semmissé tételét, ami lehetővé tette a módszer további technológiai fejlesztését.
Mivel a direkt módszer jelenleg elkerüli a nem specifikus reakciókat, az automatizált módszerek túlnyomórészt a közvetlen immunfluoreszcencia módszert alkalmazzák.
A kézi mikroszkópos értékelés eredményeit az úgynevezett "keresztekben" (egy +-tól négy ++++-ig) írják le - a reakció súlyosságának szubjektív fokozata a kutató szemével. Az automatizált eljárásokban fotosokszorozókat vagy nagy érzékenységű fluoreszcens kamerákat használnak detektorként, amely lehetővé teszi a jel nagy pontosságú rögzítését és a relatív fluoreszcencia szint (relatív fluoreszcencia arány) értékét a skála széles tartományában adja meg. Az abszolút értéket a mintában ismert állandó tartalmú kontrollok vagy antigének segítségével számítják ki. Automatizált módszerek alkalmazása esetén az adatfeldolgozást speciális programok végzik képfeldolgozásra és citometrikus adatok elemzésére.
A módszer meghatározó jelentőségű az onkológiai betegségek (immunhisztokémia, onkohematológia) korai diagnosztizálásában és kezelésében, a fertőző betegségek diagnosztizálásában (például CD4+ sejtek meghatározása HIV-ben), valamint az örökletes szindrómákban. Intenzíven fejlődnek az automatizált módszerek, köztük a nagy tartalmú képalkotás és a nagy tartalmú citometria területe, a 90- es évek óta párhuzamosan fejlődő citometria-mikroszkópos kombinált módszerek ( citométer-mikroszkóp ), valamint a plazmonholográfiás mikrochip citometria módszerei. [3] , amelyben az egyes antitesteket nanorészecskékkel jelölik.
| Patológia az orvostudományban | |
|---|---|
| patohistológia | Sejtkárosodás apoptózis Nekrobiózis kariopiknózis karyorrhexis kariolízis Elhalás koagulációs nekrózis kollikvációs nekrózis üszkösödés zárolás szívroham Sejtes adaptáció Sorvadás Hipertrófia Hiperplázia Diszplázia Metaplasia pikkelyes mirigyes Disztrófia Fehérje zsíros szénhidrát Ásványi |
| Tipikus kóros folyamatok |
|
| Laboratóriumi diagnosztika és boncolás |
|