A triplex DNS , a H-DNS vagy a triplex-DNS olyan DNS - forma , amelyben három oligonukleotid egymás körül hármas hélixet képez. A háromszálú DNS-ben a harmadik DNS-szál kötődik a DNS kettős szálú B formájához, amelyet Watson-Crick kölcsönhatások, Hoogsteen kölcsönhatások vagy fordított Hoogsteen hidrogénkötések alakítanak ki . A háromszálú DNS megzavarhatja a normál replikációt , és növelheti a mutációk gyakoriságát a képződési régióban.
A triplex-képző oligonukleotidok (TFO-k) 15-25 nukleotid hosszúságú oligonukleotidok , amelyek a kettős szálú DNS fő barázdájához kötődnek, és intermolekuláris triplex DNS-t alkotnak. A TFO-k a DNS kettős hélixhez kötődve elnyomhatják a transzkripciót , mivel ebben az esetben a transzkripciós faktorok kötőhelyei nem hozzáférhetők. A TFO sejtbe juttatása felhasználható a génexpresszió szabályozására, a helyspecifikus mutagenezisre , és a jövőben a génterápiás stratégiák egyikévé válhat .
A timin (T) kölcsönhatásba léphet a Watson - Crick T- A párral egy Hoogsteen-hidrogénkötésen keresztül. A timin az eredeti T-A párban lévő adeninnel hidrogénkötéseket hoz létre, és így T-A*T triplettet képez [1] . Savas környezetben a protonált citozin (C+) is kölcsönhatásba léphet a C – G párral Hoogsteen kölcsönhatásokon keresztül, és így a C–G*C+ triplettet alkotja. A T-A*T és C-G*C+ hármasok a lehető legstabilabb hármasok, míg a T-A*G és C-G*G hármasok a legkevésbé stabilak [2] .
A háromszálú DNS-nek két osztálya van: intramolekuláris és intermolekuláris. Intermolekuláris triplex DNS esetén kötés jön létre a DNS-duplex és egy másik, külső DNS-szál között, amely lehet homológ kromoszómából , vagy lehet triplexet alkotó oligonukleotid (TFO ) . Az intramolekuláris háromszálú DNS ismétlődő tükörszimmetriájú homopurin és homopirimidin régiókat tartalmazó duplexből jön létre [3] . A kialakuló intramolekuláris háromszálú DNS mennyiségét a DNS szuperspirálozás mértéke befolyásolja [4] . Kétféle intramolekuláris triplex DNS létezik: H-DNS és H*-DNS. A H-DNS savas környezetben , kétértékű kationok , például Mg 2+ jelenlétében képződik . Ebben a konformációban a duplex homopirimidin lánca visszafordul, hogy párhuzamosan kötődjön a purinlánchoz. Ezt a konformációt a T—A*T és C—G*A+ alaphármas hármas stabilizálja. Az utolsó triád esetében a citozint protonálni kell, ezért a H-DNS képződéséhez savas környezet szükséges [5] . A H*-DNS semleges pH-értékeken képződik kétértékű kationok jelenlétében. A H*-DNS esetében a homopirimidin és a purin lánc antiparallel módon kötődik egymáshoz. A H*-DNS-t a T—A*A és C—G*G triád stabilizálja [3] [5] .
A triplex-képző oligonukleotidok (TFO-k) 15-25 nukleotid hosszúságú oligonukleotidok , amelyek a kettős szálú DNS fő barázdájához kötődnek, és intermolekuláris triplex DNS-t alkotnak. Számos bizonyítékot kaptak arra vonatkozóan, hogy ezek az oligonukleotidok in vivo részt vehetnek a génexpresszió szabályozásában [6] .
A TFO-k hajlamosak homopurin vagy homopirimidin helyekhez kötődni, amelyek leggyakrabban a gének promótereinek és intronjainak régiójában találhatók [7] . A TFO-k a DNS kettős hélixhez kötődve elnyomhatják a transzkripciót , mivel ebben az esetben a transzkripciós faktorok kötőhelyei nem hozzáférhetők. A TFO sejtbe transzfekcióval vagy más módszerekkel történő bejuttatása felhasználható a génexpresszió szabályozására [8] , a helyspecifikus mutagenezisre , és a jövőben a génterápiás stratégiák egyikévé válhat . Például 2004-ben létrehozták a TFO-t, amely specifikusan az ETS2 transzkripciós faktort kódoló gén promoteréhez kötődik, amelynek túlzott expressziója gyakran megfigyelhető prosztatarákban [9] . Kifejlesztették a TFO-t, amely specifikusan kölcsönhatásba lép a bcl-2 gén promoterével, amely egy apoptózis -represszor fehérjét kódol [10] .
A háromszálú DNS képződéséből adódó transzkripció elnyomása emberi betegségek és kóros állapotok hátterében állhat. Így Friedreich-ataxiában a H-DNS képződése blokkolja az FXN gén 1. intronjának expresszióját [11] . Ez végső soron neurodegeneratív folyamatok beindulásához vezet az idegrendszerben és mozgászavarokhoz a végtagokban [12] . A triplex DNS képződését a nukleotid kivágás javítórendszere ismeri fel , amely javítja a kettős szálú DNS szerkezetét [13] .
A szintetikus peptidonukleinsavak (PNA) kölcsönhatásba léphetnek a duplex DNS-sel is , amelyben a cukor-foszfát gerincet egy pszeudopeptid váz váltja fel . Amikor a peptidonukleinsav a duplex DNS-hez kötődik, az egyik DNS-szál elmozdul, és P-hurok képződik. A peptidonukleinsavak rezisztensek a proteázokkal szemben, és a H-DNS képződése miatt a céllókusz javítására használhatók . A PNA-k Watson-Crick kölcsönhatásokon keresztül nagy affinitással és specifitással kötődhetnek a DNS komplementer szálához. A triplex DNS kialakulása során a PNS Hoogsteen kölcsönhatásokon keresztül lép kölcsönhatásba a duplexszel [14] . A valódi triplex DNS-től eltérően a PNA és a kettős szálú DNS hibridje stabil, mivel a PNA nem negatív töltésű cukor-foszfát vázat, hanem semleges pszeudopeptid gerincet tartalmaz [15] . Ellentétben a TFO-kkal, amelyek a fő horony régiójában kötődnek a duplex DNS-hez, a PNS-ek különböző módon lépnek kölcsönhatásba a DNS kettős hélixszel [14] .
A vegyes összetételű duplex DNS-szekvenciát egy pszeudo-komplementer PNS-pár ismeri fel, amelyek kétszeresen behatolhatnak a DNS-hélixbe a diaminopurin (D) és a tiouracil ( US ) egyidejű képződése miatt , amely az adenint és a timint [16] . A pszeudo-komplementer PNS-ek a PNA:DNS összetétel hélixeit alkotják az egyes duplex szálakkal a D–T, U S –A, G–C és C–G párok kialakulása miatt. A duplex invázió másik formája a homopurin PNA-val valósítható meg az antiparallel DNS-szállal való komplementer kölcsönhatás miatt [17] [15] .
Végül a PNA-k kémiai módosítás eredményeként „bilincset” képezhetnek a célhelyen. A „bilincsek” egyik típusa két PNA-ból álló szerkezetet foglal magában, amelyeket egy rugalmas linker – 8-amino-3,6-dioxaoktánsav – kapcsol össze [18] . Ez a struktúra PNA:DNS:PNS triplexet képez a célhelyen, ahol az egyik PNS kölcsönhatásba lép az antiparallel DNS szálal Watson-Crick párok segítségével, míg a másik szál Hoogsteen párokat alkot a másik szállal, a második szálnak szükségszerűen tartalmaznia kell homopurin vagy homopirimidin hely, amellyel a PNA kölcsönhatásba lép [17] . A „bilincs” egy másik formája „farok szorító ” néven ismert . Egy PNA:DNS:PNA bilincsből és egy további DNS:PNA duplexből áll, amely egy 5-10 bp hosszúságú farkat alkot . Ebben az esetben nincs szükség homopurin vagy homopirimidin helyre az eredeti DNS-duplexben [15] .
Egy ilyen instabil struktúra, például a H-DNS kialakulása genomiális instabilitást okozhat a megjelenés helyén [19] . Például a c-MYC gén P1 promótere mellett vannak olyan polipurin régiók, amelyek képesek triplex DNS kialakítására, és kialakulása az instabilitás növekedéséhez vezet a c-MYC közelében . A transzgenikus egereken kísérletek kimutatták, hogy a triplex állapotba való átmenetre hajlamos humán szekvenciák, valamint a Z-DNS -be átjutó szekvenciák bejuttatása a genom olyan régióiba, amelyeknél nem ismertek genetikai instabilitás esetei, az instabilitás megjelenésére.bennük [20] . Ezenkívül ismert, hogy a H-DNS képződése elősegítheti a 14 - es és 18 -as kromoszómák közötti transzlokációkat , amelyek számos rák , például follikuláris limfóma hátterében állnak . A tudósok kimutatták, hogy a H-DNS képződés valószínűségének csökkentése a transzlokációk valószínűségét is csökkenti [20] [21] .
A háromszálú DNS megzavarhatja a normál replikációt , és más nem kanonikus DNS-struktúrákhoz hasonlóan növelheti a mutációk gyakoriságát a képződési régióban [22] . Ahogy fentebb megjegyeztük, a H-DNS fizikai akadályt jelenthet a transzkripció előtt. Amint a T7 RNS polimerázzal végzett kísérletek kimutatták , a transzkripciós apparátus nem tudta leküzdeni a triplex láncokat megkötő Watson-Crick és Hoogsteen kölcsönhatásokat, ami a transzkripció leállásához vezetett [23] . A transzkripciós leállás a transzkripciós gépezet és a H-DNS ütközésekor aktiválja a transzkripcióhoz kapcsolt javítást, aminek következtében a H-DNS kivágódik, ami deléciókhoz vezet [24] .
A háromszálú DNS-t különféle nukleázok ismerhetik fel . Például az ERCC1-XPF és az ERCC1-XPG nukleázok, amelyek részt vesznek a nukleotid-kivágás javításában, a H-DNS-t a hurok régiójában vágják el, amelyet a Hoogsteen-párokon keresztül kölcsönhatásba lépő szálak és a Watsont alkotó szál 5'-vége alkot. -Crick párok [25] . Ez a rés nagy deléciókhoz vezethet, amelyek genomiális instabilitáshoz vezetnek. A FEN1 nukleáz ezzel szemben megakadályozza a genomi instabilitást. Az ERCC1-XPG-hez hasonlóan megszakítja a H-DNS-t a lánc 5'-végén, amely nem vesz részt a Hoogsteen-kölcsönhatásokban. A FEN1 -et nem tartalmazó HeLa sejtekben a H-DNS közelében lévő deléciók száma nagyobb, mint a FEN1-et tartalmazó sejtekben, és a H-DNS mutagén hatása a FEN1-et nem tartalmazó sejtekben a DNS-replikáció során volt a legkifejezettebb. Így a FEN1 replikációfüggő módon gátolja a H-DNS által kiváltott mutagenezist [22] [25] .
Mint fentebb említettük, a TFO génterápiás eszköz lehet. A TFO és a peptidonukleinsavak orvosi alkalmazásának fő nehézsége a sejtekhez való eljuttatása [26] . 2013-ban a vérképző sejtekben a génexpresszió megváltoztatását célzó tanulmány részeként javasolták a peptidonukleinsav molekulák és a sejtbehatoló peptidek (CPP -k , valamint a poli ( tej-ko-glicinsav) nanorészecskéinek keresztkötését [27] . Ezzel a megközelítéssel a munka szerzőinek 6 bázispárt sikerült módosítaniuk a CCR5 génben , amelyek mutációi HIV rezisztenciával hozhatók összefüggésbe [28] . A CCP-k lehetővé teszik kis "rakományok", például kis biomolekulák szabad bejutását a sejtekbe . A poli(tej-ko-glikoinsav) egy biológiailag lebomló polimer , amely peptidonukleinsav-molekulákat képes részecskékké kapszulázni. A peptidonukleinsavak nanorészecskék összetételében a célsejtekhez való eljuttatását egy másik, a cisztás fibrózis kezelésével foglalkozó tanulmányban alkalmazták . A peptidonukleinsavakat a DNS-donor molekulával együtt nanorészecskékbe csomagolták, és a hörgőhámsejtekbe juttatták a CFTR gén mutációjának szerkesztése érdekében [29] .
Az 1950-es években, amikor még nem ismerték a DNS pontos szerkezetét, a háromszálú hélixet a DNS sejtben való szerveződésének egyik lehetséges modelljeként tekintették. A DNS háromszálú szerkezetét Linus Pauling és Robert Corey [ tartotta a legvalószínűbbnek, akik 1953-ban bemutatták a háromszálú DNS-modellt [ 30] [31] . Watson és Crick, aki később kémiai Nobel-díjat kapott a DNS szerkezetének meghatározásáért, kezdetben szintén a háromszálú modell felé hajlott, de számos olyan problémát láttak benne, amelyek nem voltak összhangban az akkor rendelkezésre álló kísérleti adatokkal. . Különösen a negatív töltésű foszfátok , amelyek a hélix tengelye felé néznek, elektrosztatikus okokból taszítanák egymást , lehetetlenné téve egy stabil hármas hélix létezését. Pauling és Korey háromszálú modelljében néhány van der Waals távolság túl kicsi volt. R. Fraser javasolta a tripla hélix modelljét is , amelyben a foszfátok a hélix felszínén helyezkedtek el, a nitrogéntartalmú bázisok pedig befelé fordultak, de ezt kísérleti adatok nem támasztották alá [32] .
1957-ben egy alternatív háromszálú DNS-szerkezetet javasoltak [33] . J. Fensenfeld, D. R. Davis és A. Rich azt jósolta, hogy stabil háromszálú DNS képződhet, ha az egyik szál csak purin nukleotidokból, a másik kettő pedig csak pirimidinekből áll [6] [33] . Úgy gondolták, hogy in vivo ilyen szerkezet csak a RecA fehérje hatásának köztes termékeként jön létre az Escherichia coli baktériumban történő rekombináció során . Az 1960-as években javasolt háromszálú DNS-modellek nem Watson-Crick, hanem Hoogsteen párok kialakulását jósolták a DNS-nagy barázdában [6] . Nem sokkal később egy háromszálú DNS-modellt javasoltak, amely egy pirimidin- és két purinláncból áll [6] . A háromszálú DNS felfedezése élő sejtekben az 1980-as évek végén szuperspirált plazmidok részeként azt mutatta, hogy a H-DNS képződése elvileg lehetséges élő sejtekben [34] . Ezen túlmenően hamarosan kiderült, hogy a homopirimidin és néhány purinban gazdag oligonukleotid képes kötődni a duplex DNS specifikus szekvenciáihoz, ami háromszálú DNS kialakulásához vezet [35] .