Transzfekció

Az oldal jelenlegi verzióját még nem ellenőrizték tapasztalt közreműködők, és jelentősen eltérhet a 2020. február 21-én felülvizsgált verziótól ; az ellenőrzések 2 szerkesztést igényelnek .

A transzfekció  egy nukleinsav eukarióta sejtekbe való bejuttatásának folyamata nem vírusos módszerrel [1] . A prokariótákhoz hasonló folyamatot transzformációnak nevezünk .

A transzfekció általában a plazmamembrán nyílásainak kialakításával jár , amelyeken keresztül extracelluláris anyag juthat be a sejtbe. Genetikai anyagok, például DNS vagy RNS , valamint fehérjék , például antitestek transzfektálhatók . A transzfekcióhoz gyakran használnak erős elektromos teret ( elektroporációt ) vagy elektrosztatikusan feltöltött lipideket , amelyek képesek liposzómák , struktúrák kialakítására, amelyek összeolvadnak a plazmamembránnal, és a bennük lévő anyagot a sejtbe kilökik. Más transzfekciós eljárások is ismertek.

A transzfekció szó eredeti jelentése : transzformációt szolgáló fertőzés, vagyis egy vírusgenom sejtekbe való bejuttatása , melynek eredményeként a fertőzés megindul. Mivel azonban a transzformáció kifejezés mást jelent az emberek és az állatok esetében (genetikai változások, amelyek lehetővé teszik a sejtek hosszú távú tenyészetben tartását, túllépve a Hayflick-határt , ami például a rákos sejtekre jellemző), A transzfekció kifejezést javasolták a transzformáció kifejezés helyettesítésére abban az értelemben, hogy a fenotípust idegen nukleinsav bejuttatásával megváltoztatjuk.

Transzfekciós módszerek

A transzfekcióhoz használt anyagok három fő típusból állnak: mikrorészecskék, kationos polimerek és liposzómák.

Az egyik legolcsóbb és legkevésbé megbízható módszer az 1970-es években feltalált kalcium-foszfátos transzfekció [2] [3] ). A HEPES puffert , foszfátot és DNS-t tartalmazó izotóniás oldatot kalcium-kloriddal keverjük össze. Kalcium-foszfát részecskékből és DNS-ből csapadék képződik, amelynek mérete nanométeres tartományba esik. A szuszpenziót a sejttenyészethez adjuk, amely abszorbeálja a részecskéket (hogyan pontosan, azt a szerzők nem határozták meg). Ez a transzfekció a humán embrionális vesesejtek 293-as vonalával (HEK 293) működik a legjobban , de sok más sejtvonal transzfektálódik valamivel kisebb hatékonysággal.

Egy hatékonyabb módszer liposzómákat használ, a sejteknél sokkal kisebb méretű struktúrákat, amelyek egy vizes fázisban lévő DNS-t körülvevő lipidmembránból állnak. Felépítésük a sejtek szerkezetére hasonlít, amelyeket szintén foszfolipid membrán vesz körül. A liposzómák összeolvadhatnak a sejtmembránnal, majd belső terük összeolvad a sejtek tartalmával. A liposzómák kialakításához általában pozitív töltésű lipideket használnak, mivel a DNS és a sejtfoszfolipidek negatív töltésűek, és a különböző elektrosztatikus töltésű részecskék vonzódnak egymáshoz.

A transzfekció másik módja a pozitív töltésű vízoldható polimerek, például a DEAE-dextrán vagy a polietilénimin alkalmazása. A negatív töltésű DNS megköti a polikationokat, és a kapott komplexet a sejtek endocitózissal felveszik .

A DNS mikroinjekcióval vagy " génpisztoly " segítségével is bejuttatható a sejtekbe . Ez utóbbi inert szilárd anyag (általában arany) mikrorészecskéit használja, amelyekhez a DNS-t fuzionálják.

Az impafektálás egy olyan génbejuttatási módszer , amely nanoanyagokat , például szén nanoszálakat , szén nanocsöveket , nanohuzalokat használ . A tűszerű nanostruktúrákat a hordozó felületére merőlegesen szintetizálják. A gént tartalmazó, intracelluláris bejuttatásra szánt plazmid DNS a nanostruktúra felületéhez kapcsolódik. Az ilyen tűket tartalmazó chipet ezután a sejtekhez vagy szövetekhez nyomják. A nanostruktúráknak kitett sejtek expresszálhatják a szállított gén(eke)t.

Egyéb transzfekciós módszerek közé tartozik az elektroporáció , a nukleofekció, a hősokk, a mágneses részecskék használata és a kutatási termékek gyártói által forgalmazott különféle kereskedelmi reagensek.

Ezenkívül a DNS-t vírusok juttathatják el a sejtekhez. Ebben az esetben a folyamatot transzdukciónak nevezik , és a sejtek transzdukálódnak.

A transzfekció stabil és átmeneti

A probléma megoldásához gyakran elegendő, ha a DNS-t csak egy ideig juttatják be a sejtekbe, ami elegendő az expressziójához . Mivel a transzfektált DNS normál esetben nem épül be a nukleáris genomba, és nem replikálódik, az idegen DNS gyorsan elveszik a sejtek szaporodásával. Az ilyen transzfekciót átmenetinek nevezzük .

Ha a bejuttatott gént a transzfektált sejtek utódjaiban rögzíteni kell, akkor azt be kell vonni a nukleáris genomba. Az ilyen transzfekciót stabilnak nevezzük . Ennek érdekében egy másik gént juttatnak a sejtekbe, ami megkönnyíti a transzfektált sejtek szelekcióját, ezért szelekciós markernek nevezik . Például egy szelekciós marker lehet valamilyen antibiotikummal szembeni rezisztenciagén . Egyes sejtek teljesen véletlenül tartalmaznak idegen DNS-t a genomjukban, és ebben az esetben a feladat csak az ilyen sejtek utódainak (klónjának) kiválasztása, ami könnyen elvégezhető olyan antibiotikum jelenlétében, amely minden sejtre káros, kivéve a transzfektált sejteket. .

A geneticint, más néven G418-at, puromicint, doximicint stb., gyakran használják antibiotikumként a transzfektált sejtek szelekciójára.

Az idegen DNS beépülése a sejtgenomba a sejtben található javító mechanizmus miatt következik be . Ezért az inszerció hatékonysága megnő, ha a sejtekbe bevitt DNS lineáris, nem pedig cirkuláris, ahogyan a bakteriális plazmidok általában . Természetesen a restrikciós enzimek jelenléte a sejtekben bizonyos mértékig biztosítja a cirkuláris plazmidok véletlenszerű linearizációját, de előfordulhat a szelekciós gén vagy a genomba integrálandó gén szerint is. Ezért a génmanipulált konstrukciókat általában előre linearizálják, amikor stabil transzfekciót készítenek.

Még több előkészítő munka megköveteli egy gén beillesztését a genom egy meghatározott helyére, ami szükséges például a genetikai knockouthoz . Ebben az esetben egy génmanipulált konstrukcióban a kromoszómába bevitt génkazettának a kromoszómális DNS-sel komplementer két, 1000-3000 bázispár hosszú szakasz (ún. vállak ) között kell elhelyezkednie.

Jegyzetek

  1. ↑ Transzfekció (lefelé irányuló kapcsolat) . Hozzáférés dátuma: 2008. szeptember 26. Az eredetiből archiválva : 2008. december 17. 
  2. ↑ Graham FL, van der Eb AJ Új technika a humán adenovírus 5 DNS fertőzőképességének vizsgálatára  //  Virology : Journal. - 1973. - 1. évf. 52 , sz. 2 . - P. 456-467 . - doi : 10.1016/0042-6822(73)90341-3 . — PMID 4705382 .
  3. ↑ Bacchetti S., Graham F. A timidin-kináz génjének átvitele timidin-kináz-hiányos emberi sejtekbe kimerült herpes simplex vírus DNS-sel  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States  : folyóirat  . - 1977. - 1. évf. 74 , sz. 4 . - P. 1590-1594 . - doi : 10.1073/pnas.74.4.1590 . — PMID 193108 .

Irodalom

Linkek

  Ugrás a Wikidata elemre  Szótárak és enciklopédiák