Sejttenyésztés

Az oldal jelenlegi verzióját még nem ellenőrizték tapasztalt közreműködők, és jelentősen eltérhet a 2021. május 24-én felülvizsgált verziótól ; az ellenőrzések 5 szerkesztést igényelnek .

A sejttenyésztés olyan folyamat, amelynek során prokarióták és eukarióták egyetlen sejtjét (vagy egyetlen sejtjét) in vitro szaporítják ellenőrzött körülmények között . A gyakorlatban a " sejtkultúra " kifejezés főként többsejtű eukariótákból, leggyakrabban állatokból származó egyszövetű sejtek tenyésztésére vonatkozik. A sejtkultúrák termesztésének technológiájának és technikáinak történelmi fejlődése elválaszthatatlanul összefügg a szövettenyészetek és az egész szervek termesztésével.

Történelem

A 19. században S. Ringer angol fiziológus nátrium-, kálium-, kalcium- és magnézium-kloridot tartalmazó sóoldatot [1] fejlesztett ki , hogy fenntartsa az állatok szívverését a testen kívül. 1885- ben Wilhelm Roux megalkotta a szövettenyésztés elvét, eltávolította a csontvelő egy részét a csirkeembrióból, és több napig meleg sóoldatban tartotta [2] . Ross Granville Harrison , aki a Johns Hopkins School of Medicine-ben, majd a Yale Egyetemen dolgozott , 1907-1910-ben publikálta kísérleteinek eredményeit, és megalkotta a szövettenyésztési módszertant. 1910-ben Peyton Rous csirke szarkóma sejtkultúrával dolgozott, egészséges állatokban daganatok kialakulását idézte elő. Ez később az onkogén vírusok felfedezéséhez vezetett ( fiziológiai és orvosi Nobel-díj 1966).

A sejttenyésztési technikák az 1940-es és 1950-es években jelentősen fejlődtek a virológiai kutatások kapcsán. A vírusok sejttenyészetekben történő tenyésztése lehetővé tette, hogy tiszta vírusanyagot nyerjenek vakcinák előállításához. A gyermekbénulás elleni vakcina volt az egyik első olyan gyógyszer, amelyet sejttenyésztési technológiával tömegesen gyártottak. 1954-ben Enders , Weller és Robbins Nobel-díjat kapott "a gyermekbénulás vírus különféle szövettenyészetekben való növekedési képességének felfedezéséért". 1952-ben fejlesztették ki a jól ismert emberi rákos sejtvonalat, a HeLa -t .

A termesztés alapelvei

Cell izolálás

A testen kívüli tenyésztéshez az élő sejteket többféleképpen lehet előállítani. A vérből sejteket lehet izolálni, de a tenyészetben csak a leukociták növekedhetnek. Mononukleáris sejtek izolálhatók lágy szövetekből olyan enzimek segítségével , mint a kollagenáz , tripszin , pronáz , amelyek elpusztítják az extracelluláris mátrixot [3] . Ezenkívül szövet- és anyagdarabok helyezhetők el a tápközegben.

A közvetlenül az objektumról ( ex vivo ) vett sejttenyészeteket elsődlegesnek nevezzük [4] . A legtöbb primer sejt, a tumorsejtek kivételével, korlátozott élettartamú. Bizonyos számú osztódás után az ilyen sejtek megöregednek és abbahagyják az osztódást, bár továbbra is életképesek maradhatnak.

Vannak halhatatlanná tett ("halhatatlan") sejtvonalak , amelyek korlátlanul képesek szaporodni. A legtöbb tumorsejtben ez a képesség véletlenszerű mutáció eredménye , de néhány laboratóriumi sejtvonalban mesterségesen, a telomeráz gén aktiválásával szerzik meg [5] [6] .

Sejtkultúra

A sejteket speciális tápközegben , állandó hőmérsékleten növesztik. Növényi sejttenyészeteknél szabályozott világítást alkalmaznak, az emlőssejteknél pedig általában speciális gáznemű környezetre is szükség van, amelyet sejtkultúra-inkubátorban tartanak fenn [7] [8] . A levegőben általában szabályozzák a szén-dioxid és a vízgőz koncentrációját, de néha az oxigént is. A különböző sejttenyészetekhez használt tápközegek összetételében, pH - jában, glükózkoncentrációjában , növekedési faktorok összetételében stb. különböznek [9] . Az emlős sejttenyésztő tápközegben használt növekedési faktorokat leggyakrabban a vérszérummal együtt adják hozzá . Az egyik kockázati tényező ebben az esetben a sejttenyészet prionokkal vagy vírusokkal való fertőzésének lehetősége. A termesztésben az egyik fontos feladat a szennyezett összetevők felhasználásának elkerülése vagy minimalizálása. A gyakorlatban azonban ez nem mindig valósítható meg. A legjobb, de egyben a legdrágább módszer a tisztított növekedési faktorok hozzáadása a szérum helyett [10] .

A sejteket szuszpenzióban vagy adhezív állapotban növeszthetjük . Egyes sejtek (például vérsejtek ) természetesen szuszpenzióban léteznek. Vannak olyan sejtvonalak is, amelyeket mesterségesen módosítottak, hogy ne tapadhassanak a felületekhez; ezt a tenyészetben lévő sejtek sűrűségének növelése érdekében teszik. A tapadó sejtek növekedéséhez extracelluláris mátrix elemekkel bevont felületre, például szövettenyészetre vagy műanyagra van szükség a tapadási tulajdonságok javítása, valamint a növekedés és a differenciálódás serkentése érdekében. A legtöbb lágy és kemény szövet sejtje tapadó. Az adhezív típusú tenyészet közül megkülönböztetik az organotipikus sejttenyészeteket, amelyek a hagyományos laboratóriumi üvegárukkal ellentétben háromdimenziós környezetet jelentenek. Ez a tenyésztési rendszer fizikailag és biokémiailag a leginkább hasonlít az élő szövetekhez, de karbantartása technikailag nehézségekbe ütközik (például diffúziót igényel). Az adhezív tenyészetek tenyésztéséhez és a szövetmérnöki struktúrák extracelluláris mátrixának térfogatának feltöltéséhez szükséges fizikai feltételek biztosítása érdekében dinamikus tenyésztési rendszereket [11] alkalmaznak, amelyek rotációs és vortex bioreaktorokon, állványzattal közvetlenül érintkező bioreaktorokon: kompressziós bioreaktorok. , mechanikai feszítéssel és hidrosztatikus nyomással működő bioreaktorok, speciális bioreaktorok a sejtek és szövetek elektromos stimulálására, valamint kombinált bioreaktorok [12] .

Sejtvonalak keresztszennyeződése

Amikor sejtkultúrákkal dolgoznak, a tudósok szembesülhetnek a keresztszennyeződés problémájával.

A növekvő sejtek jellemzői

A sejtek szaporítása során az állandó osztódás miatt előfordulhat, hogy túlburjánzik a tenyészetben, és ennek eredményeként a következő problémák merülnek fel:

A sejttenyészetek normális működésének fenntartása, valamint a negatív jelenségek megelőzése érdekében a táptalajt időszakonként cserélik, a sejteket passzálják és transzfektálják . A tenyészetek baktériumokkal, élesztőkkel vagy más sejtvonalakkal való szennyeződésének elkerülése érdekében minden manipulációt általában aszeptikus körülmények között, steril dobozban végeznek. Antibiotikumok ( penicillin , streptomycin ) és gombaellenes szerek ( amfotericin B ) adhatók a táptalajhoz a mikroflóra elnyomására .

A sejtekben az anyagcsere egyik terméke a savak, amelyek hatására a tápközeg pH -ja fokozatosan csökken. A tápközeg savasságának szabályozására pH indikátorokat adnak hozzájuk .

Ha a sejttenyészet tapad, a tápközeg teljesen kicserélhető.

Cellák áthaladása

A sejtek passzálása (szétválasztása)  kis számú sejt kiválasztása egy másik laboratóriumi edényben történő növekedés céljából. Ha a kultúra gyorsan növekszik, ezt rendszeresen meg kell tenni, mivel a tápanyagok kimerülnek a tápközegben, és felhalmozódnak az anyagcseretermékek . A szuszpenziós tenyészetek könnyebben passzálhatók, mivel elég csak kiválasztani a szükséges számú sejtet, más edényekbe helyezni, és friss táptalajt adni. A ragasztósejteket ezt megelőzően le kell választani az aljzatról, és szét kell választani a klasztereiket. Leggyakrabban tripszin és EDTA keverékét vagy más enzimkeveréket használnak erre a célra , néha csak az EDTA fiziológiás sóoldatban (Versen-oldat) elegendő. Ha a tenyészet lassan növekszik, általában anélkül etetjük, hogy másik edénybe helyezzük át, időnként (általában 2-3 naponta egyszer) a használt táptalaj egy részét elvonva és frissen hozzáadva.

Transzfekció és transzdukció

Tenyésztésük során transzfekcióval (nem vírusos módszerrel) idegen DNS kerülhet a sejtekbe . Ezt a technológiát gyakran használják szabályozott génexpresszióra . Viszonylag a közelmúltban az mRNS transzfekciót sikeresen megvalósították ezekre a célokra .

A DNS -t vírusok vagy bakteriofágok is bejuttathatják a sejt genomjába . Ezek intracelluláris paraziták a legalkalmasabbak erre a célra, mivel a genetikai anyag bejuttatása a gazdasejtbe az életciklusuk normális része [13] . Ezt a módszert transzdukciónak nevezik .

Humán sejtvonalak

Az emberi sejtek tenyésztése némileg ellentétes a bioetikai szabályokkal , mivel az izoláltan termesztett sejtek túlélhetik a szülői szervezetet, majd kísérletek elvégzésére vagy új kezelések kidolgozására és abból profitálhatnak. Az első bírósági határozat ezen a területen a Kaliforniai Legfelsőbb Bíróságon született a John Moore kontra Kaliforniai Egyetem ügyében , amely szerint a betegeknek nincs tulajdonjoguk a beleegyezésükkel eltávolított szervekből nyert sejtvonalakhoz [14] .

Hybridoma

A hibridóma  olyan sejtvonal, amely normális limfociták és „halhatatlan” rákos sejtek fúziójából származik. Monoklonális antitestek előállítására használják . Az immunizált állatok lépéből vagy véréből izolált leukociták a szükséges specifitású antitesteket termelnek, de mint minden primer tenyészetnél, szaporodási képességüket a Hayflick-határ korlátozza . A halhatatlanná tétel érdekében mesterségesen fuzionálják őket egy "halhatatlan" mielóma sejtvonallal , ami a tulajdonságok rekombinációját eredményezi. Ezt követően a sejtvonalat klónozzák, és olyan klónokat választanak ki , amelyek egyidejűleg képesek korlátlan szaporodásra és antitestek termelésére a kiválasztott antigén ellen .

Sejttenyészetek használata

A tömegsejtkultúra a vírusvakcinák és számos biotechnológiai termék ipari előállításának alapja .

Biotechnológiai termékek

A sejttenyészetekből ipari módszerrel olyan termékeket állítanak elő, mint az enzimek , szintetikus hormonok , monoklonális antitestek , interleukinek , limfokinek , daganatellenes gyógyszerek . Bár sok egyszerű fehérje viszonylag könnyen előállítható rDNS segítségével baktériumtenyészetekben, összetettebb fehérjék, például glikoproteinek jelenleg csak állati sejtekből nyerhetők. Az egyik ilyen fontos fehérje az eritropoetin hormon . Az emlős sejtkultúrák termesztésének költsége meglehetősen magas, ezért jelenleg is kutatják annak lehetőségét, hogy komplex fehérjéket állítsanak elő rovar- vagy magasabb rendű növényi sejttenyészetekben .

Szövettenyészetek

A sejttenyésztés a szövettenyésztési technológia és a szövetsebészet szerves része, mivel ez határozza meg a sejtek növekedésének és életképes állapotban tartásának alapjait ex vivo .

Vakcinák

Sejttenyésztési technikák alkalmazásával jelenleg is készülnek a poliomyelitis , a kanyaró , a mumpsz , a rubeola és a bárányhimlő elleni vakcinák . A vírus H5N1 törzse által okozott influenzajárvány veszélye miatt az Egyesült Államok kormánya jelenleg is finanszírozza a madárinfluenza elleni vakcina kutatását sejtkultúrák felhasználásával.

Nem emlős sejttenyészetek

Növényi sejttenyészetek

A növényi sejttenyészeteket általában folyékony tápközegben szuszpenzióként vagy szilárd táptalajon kallusztenyészetként termesztik . A differenciálatlan sejtek és kallusz tenyésztése megköveteli a növényi növekedési hormonok, auxinok és citokininek bizonyos egyensúlyának fenntartását .

Bakteriális, élesztő kultúrák

Kis számú baktérium- és élesztősejt tenyésztéséhez a sejteket zselatin vagy agar-agar alapú szilárd táptalajra szélesztjük . A tömegtermeléshez folyékony tápközegben (levesben) történő termesztést alkalmaznak.

Víruskultúrák

A vírustenyészeteket emlős- , növény- , gomba- vagy baktériumsejtkultúrákban termesztik , attól függően, hogy az adott vírustípus természetes gazdaszervezete . De bizonyos körülmények között más típusú sejtekben is termeszthetők.

Ebben az esetben maga a sejttenyészet szolgál táptalajként a vírus növekedéséhez és replikációjához.

Sejtvonalak típusai

A sejtvonalak rövid listája

A leggyakoribb sejtvonalak itt közölt listája korántsem teljes.

sejtvonal A rövidítés magyarázata szervezet Textil Morfológia Jegyzetek és linkek
293-T emberi vese (embrionális) A HEK-293 ECACC -ből származik
3T3 sejtek "3 napos transzfer, oltás 3 x 105 sejt" egér embrionális fibroblasztok Más néven NIH 3T3 CLS ECACC
721 emberi melanóma
9L patkány glioblasztóma
A2780 emberi petefészek petefészekrák ECACC
A2780ADR emberi petefészek az A2780 származéka, amely rezisztens adriamicinnel szemben ECACC
A2780cis emberi petefészek az A2780 ciszplatin-rezisztens származéka ECACC
A172 emberi glioblasztóma rosszindulatú glioma CLS ECACC
A431 emberi bőrhám laphámsejtes karcinóma CLS ECACC sejtvonaladatbázis
A-549 emberi tüdőkarcinóma hámszövet CLS DSMZ ECACC
B35 patkány neuroblasztóma ATCC  (nem elérhető link)
BCP-1 emberi perifériás leukociták HIV+ limfóma ATCC
BEAS-2B hörgőhám + adenovírus 12-SV40 vírushibrid (Ad12SV40) emberi tüdő hámszövet ATCC  (nem elérhető link)
bEnd.3 agy endothel egér kéreg endotélium ATCC
BHK-21 "Bébi hörcsög vese" hörcsög bimbó fibroblasztok CLS ECACC Olympus archiválva : 2009. december 27. a Wayback Machine -nél
BR 293 emberi mell folyami rák
BxPC3 A hasnyálmirigy-karcinóma 3. vonalának biopsziás xenográfiája emberi hasnyálmirigy adenokarcinóma hámszövet ATCC  (nem elérhető link)
C3H-10T1/2 egér embrionális mezenchimális sejtek ECACC
C6/36 Aedes albopictus (szúnyog) lárvaszövet ECACC
CHO Kínai hörcsög petefészek szürke hörcsög (Cricetulus griseus) petefészek hámszövet CLS ECACC ICLC  (nem elérhető link)
COR-L23 emberi tüdő ECACC
COR-L23/CPR emberi tüdő ECACC
COR-L23/5010 emberi tüdő ECACC
COR-L23/R23 emberi tüdő hámszövet ECACC
COS-7 Cercopithecus aethiops, eredethibás SV-40 majom Cercopithecus aethiops bimbó fibroblasztok CLS ECACC ATCC
CML T1 Krónikus myelod leukémia T-limfocita 1 emberi krónikus mieloid leukémia T-sejtes leukémia Vér
CMT kutya emlődaganat kutya mell hámszövet
D17 kutya osteosarcoma ECACC
DH82 kutya hisztiocitózis monociták/makrofágok ECACC

J Vir Meth

DU145 emberi karcinóma prosztata CLS
DuCaP Dura mater Prosztatarák emberi metasztatikus prosztatarák hámszövet 11317521
EL4 egér T-sejtes leukémia ECACC
EMT6/AR1 egér mell hámszövet ECACC
EMT6/AR10.0 egér mell hámszövet ECACC
FM3 emberi áttétek a nyirokcsomókba melanóma
H1299 emberi tüdő folyami rák
H69 emberi tüdő ECACC
HB54 hibridóma hibridóma MA2.1 mAb-t választ ki (HLA-A2 és HLA-B17 ellen) Immunológiai folyóirat
HB55 hibridóma hibridóma L243 mAb-t választ ki (HLA-DR ellen) Humán immunológia
HCA2 emberi fibroblasztok Journal of General Virology
HEK-293 emberi embrionális vese emberi vese (embrionális) hámszövet CLS ATCC
HeLa Henrietta Lacks emberi méhnyakrák hámszövet CLS DSMZ ECACC
Hepa1c1c7 Az 1. klón 1. hepatoma vonalának 7. klónja egér hepatóma hámszövet ECACC

ATCC  (nem elérhető link)

HL-60 emberi leukémia emberi mieloblasztok vérsejtek CLS ECACC DSMZ
HMEC emberi emlőhámsejt emberi hámszövet ECACC
HT-29 emberi vastagbél epitélium adenokarcinóma HT-29 ECACC

Cell Line adatbázis

Jurkat emberi T-sejtes leukémia fehérvérsejtek ECACC

DSMZ

JY emberi limfoblasztok EBV által immortalizált B-sejtek
K562 emberi limfoblasztok krónikus mieloid leukémia CLS ECACC
Ku812 emberi limfoblasztok eritroleukémia ECACC

LGC szabványok

KCL22 emberi limfoblasztok krónikus mieloid leukémia
KYO1 Kiotó 1 emberi limfoblasztok krónikus mieloid leukémia DSMZ
LNCap Nyirokcsomó Prosztatarák emberi prosztata adenokarcinóma hámszövet CLS ECACC ATCC  (nem elérhető link)
Ma-Mel 1, 2, 3….48 emberi melanoma sejtvonalak
MC-38 egér adenokarcinóma
MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 emberi mell invazív duktális emlőkarcinóma ER+, PR+ CLS
MCF-10A Michigan Cancer Foundation emberi mell hámszövet ATCC
MDA-MB-231 MD Anderson-Metasztatikus emlő emberi mell folyami rák ECACC
MDA-MB-468 MD Anderson-Metasztatikus emlő emberi mell folyami rák ECACC
MDA-MB-435 MD Anderson-Metasztatikus emlő emberi mell melanoma vagy karcinóma (nincs konszenzus) Cambridge-i patológia ECACC
MDCK II Madin Darby kutyavese kutya bimbó hámszövet CLS ECACC ATCC
MOR/0,2R emberi tüdő ECACC
NCI-H69/CPR emberi tüdő ECACC
NCI-H69/LX10 emberi tüdő ECACC
NCI-H69/LX20 emberi tüdő ECACC
NCI-H69/LX4 emberi tüdő ECACC
NIH-3T3 National Institutes of Health, 3 napos transzfer, oltás 3 x 10 5 sejt egér embrió fibroblasztok CLS ECACC ATCC
NALM-1 perifériás vér krónikus mieloid leukémia Rákgenetika és citogenetika
ÉNy-145 melanóma ESTDAB archiválva : 2011. november 16. a Wayback Machine -nél
OPCN/OPCT Onyvax [1] Prosztatarák…. emberi prosztatarák sejtvonalak Asterand archiválva : 2011. július 7. a Wayback Machine -nél
egyenrangú emberi T-sejtes leukémia DSMZ
PNT-1A / PNT 2 prosztatarák sejtvonalak ECACC
RenCa Vese karcinóma egér vese karcinóma CLS
RIN-5F egér hasnyálmirigy
RMA/RMAS egér T-sejtes rák
Saos-2 emberi osteoxarcoma CLS ECACC
Sf-9 Spodoptera frugiperda lepke Spodoptera frugiperda petefészek CLS DSMZ ECACC
SkBr3 emberi mellrák CLS
T2 emberi B-sejtek hibridómája és T-sejtes leukémia DSMZ
T-47D emberi mell csatorna karcinóma CLS
T84 emberi vastagbél karcinóma/ tüdő metasztázisok hámszövet [2] ECACC ATCC
THP1 emberi monociták akut mieloid leukémia CLS ECACC
U373 emberi glioblasztóma-asztrocitóma hámszövet
U87 emberi glioblasztóma-asztrocitóma hámszövet CLS Abcam
U937 emberi leukémiás monocitás limfóma CLS ECACC
VCaP Csigolya prosztatarák emberi metasztatikus prosztatarák hámszövet ECACC ATCC Archiválva : 2012. február 19. a Wayback Machine -nél
Vero "Vera Reno" ("zöld bimbó") / "Vero" ("igaz") Afrikai zöld majom vesehám CLS ECACC
WM39 emberi Bőr elsődleges melanoma
WT-49 emberi limfoblasztok
X63 egér melanóma
YAC-1 egér limfóma Cell Line Data Base CLS ECACC
YAR emberi B-limfociták átalakította az EBV-t [3] Human Immunology archiválva 2008. szeptember 20-án a Wayback Machine -nél

Lásd még

Jegyzetek

  1. ↑ Ringer megoldása
  2. ↑ Archivált másolat (a hivatkozás nem elérhető) . Letöltve: 2009. március 24. Az eredetiből archiválva : 2006. szeptember 1.. 
  3. ↑ A sejtek izolálhatók a szövetekből, és különböző típusokra oszthatók (hozzáférhetetlen kapcsolat) . Hozzáférés dátuma: 2009. március 24. Az eredetiből archiválva : 2009. május 26. 
  4. ↑ Laboratórium. Sejtek és szövetek tenyésztése . www.primer.ru (2003). Letöltve: 2010. március 27. Az eredetiből archiválva : 2003. május 10..
  5. ↑ Telomeráz . Dark Matter (2006. szeptember 15.). Letöltve: 2010. március 27.
  6. ↑ Maqsood MI, Matin MM, Bahrami AR, Ghasroldasht MM (2013). A sejtvonalak halhatatlansága: a létrehozás kihívásai és előnyei. Nemzetközi Sejtbiológia. 37. (10), 1038–1045. doi : 10.1002/cbin.10137 PMID 23723166
  7. ↑ Binder CO2 inkubátorok (Németország) . Techservice . Letöltve: 2010. március 27. Az eredetiből archiválva : 2012. november 19..
  8. ↑ Laboratóriumi berendezések és fogyóeszközök. Inkubátorok (2007). Letöltve: 2010. március 27. Az eredetiből archiválva : 2012. június 8.
  9. ↑ Egy bizonyos kémiai összetételű táptalaj segítségével specifikus növekedési faktorok azonosíthatók (hozzáférhetetlen kapcsolat) . Letöltve: 2009. március 24. Az eredetiből archiválva : 2007. november 10.. 
  10. ↑ LipiMAX tisztított lipoprotein oldat marhaszérumból . Selborne Biological Services (2006). Letöltve: 2010. március 27. Az eredetiből archiválva : 2012. június 8.
  11. ↑ Lundup A.V., Demchenko A.G., Tenchurin T.Kh., Krasheninnikov M.E., Klabukov I.D., Shepelev A.D., Mamagulasvili V.G., Oganesyan R.V., Orekhov A.S., Chvalun S.N., T.G. Biológiailag lebontható mátrixok stromális és epiteliális sejtek általi kolonizációjának hatékonyságának javítása dinamikus tenyésztés során  // Gének és sejtek. - 2016. - T. 11 , 3. sz . - S. 102-107 . — ISSN 2313-1829 .
  12. ↑ Guller A.E., Grebenyuk P.N., Shekhter A.B., Zvyagin A.V., Deev S.M. Daganatok szövettervezése bioreaktor technológiák segítségével  // Acta Naturae (orosz változat). - 2016. - T. 8 , 3. sz . - S. 49-65 . — ISSN 2075-8243 .
  13. ↑ A vírusfertőzés mechanizmusa
  14. ↑ V. Bogomolova. Kié a testünk? . Arcanus (2009. augusztus 3.). Letöltve: 2010. március 27. Az eredetiből archiválva : 2016. március 5..

Linkek

  Ugrás a Wikidata elemre  Szótárak és enciklopédiák
Bibliográfiai katalógusokban