A vírusvektorok a molekuláris biológusok által általánosan használt eszközök genetikai anyag sejtekbe juttatására . Ez a folyamat végrehajtható élő szervezetben ( in vivo ) vagy sejttenyészetben ( in vitro ). A vírusok speciális molekuláris mechanizmusokkal rendelkeznek ahhoz, hogy hatékonyan szállítsák genomjukat az általuk fertőzött sejtekben. A gének vagy más genetikai anyag vektor általi szállítását transzdukciónak nevezik , és a fertőzött sejteket transzdukáltnak nevezik. A molekuláris biológusok először az 1970-es években alkalmazták ezt a mechanizmust. Paul Berg λ bakteriofág DNS -t tartalmazó módosított SV40 -et használt a tenyésztett majomvesesejtek megfertőzésére [ 1 ] .
A molekuláris biológiai kutatásokban való felhasználásuk mellett a vírusvektorokat génterápiára és vakcinafejlesztésre is használják .
A vírusvektorok az adott alkalmazásukhoz vannak szabva, de jellemzően néhány kulcsfontosságú tulajdonsággal rendelkeznek.
A vírusvektorokat eredetileg a natív DNS- transzfekció alternatívájaként fejlesztették ki molekuláris genetikai kísérletekhez . A hagyományos módszerekkel, például a kalcium -foszfát-kicsapással összehasonlítva a transzdukció biztosíthatja , hogy a sejtek csaknem 100%-a fertőzött legyen anélkül, hogy komolyan befolyásolná a sejtek életképességét. Ezenkívül egyes vírusok beépülnek a sejtgenomba , elősegítve a stabil expressziót.
A gének által kódolt fehérjék vírusvektorok segítségével expresszálhatók , általában egy adott fehérje működésének tanulmányozására. A markergéneket, például a GFP -t stabilan expresszáló vírusvektorokat, különösen a retrovírusokat, széles körben használják a sejtek tartós jelölésére, hogy nyomon követhessék őket és utódjaikat, például xenotranszplantációs kísérletekben, ahol az in vitro fertőzött sejteket gazdaállatba ültetik be.
A génbeillesztés olcsóbb, mint a génkiütés . Ez azonban kevésbé megbízható eredményeket ad, mert néha nem specifikus, és más génekre nem célzott hatást fejt ki. A gazdaállat vektorai szintén fontos szerepet játszanak.
A génterápia egy módszer a betegség kialakulásáért felelős hibás gének kijavítására. A jövőben a génterápia lehetőséget nyújthat a genetikai rendellenességek , például a súlyos kombinált immunhiány , a cisztás fibrózis vagy akár a hemofília A kezelésére. Mivel ezek a betegségek bizonyos gének DNS-szekvenciájának mutációiból származnak , a génterápiás vizsgálatok során vírusokat alkalmaztak ezeknek a géneknek a vad típusú másolatait juttatja be a páciens testébe. Óriási laborsiker volt a génterápiával. A vírusgénterápiával kapcsolatos számos problémát azonban le kell küzdeni, mielőtt széles körben alkalmazzák. A vírusokra adott immunválasz nemcsak megakadályozza a gének célsejtekhez való eljutását, hanem súlyos szövődményeket is okozhat a beteg számára. Az egyik korai génterápiás kísérletben 1999-ben ez Jesse Gelsinger halálához vezetett , akit adenovírus-vektorral kezeltek. [2]
Egyes vírusvektorok, például a gamma-retrovírusok, genomjukat egy látszólag véletlenszerű helyre helyezik be a gazdaszervezet kromoszómáinak egyikén, ami megzavarhatja a sejt génműködését és rákhoz vezethet. 2002-ben egy súlyos kombinált immunhiányos retrovirális génterápiás vizsgálatban négy betegnél alakult ki leukémia a kezelés hatására; [3] három beteg gyógyult meg kemoterápia után. [4] Az adeno-asszociált vírusokon alapuló vektorok ebben a tekintetben sokkal biztonságosabbak, mivel mindig ugyanarra a helyre integrálódnak az emberi genomban, és különféle betegségekben, például Alzheimer-kórban alkalmazzák [5] .
A patogén fehérjéket expresszáló vírusokat jelenleg e kórokozók elleni vakcinaként fejlesztik a DNS-vakcinákkal megegyező indokok alapján . A T-limfociták felismerik az intracelluláris parazitákkal fertőzött sejteket a sejtben termelődő idegen fehérjék alapján. A T -sejtes immunitás kritikus fontosságú a vírusfertőzések és betegségek, például a malária elleni védelemben . A vírusvakcina a Sabin -féle gyermekbénulás elleni vakcinához és más attenuált vakcinákhoz hasonló módon indukálja a patogén fehérjék expresszióját a gazdasejtekben . Mivel azonban a vírusoltások a kórokozó génjeinek csak egy kis részét tartalmazzák, sokkal biztonságosabbak, és a kórokozó általi szórványos fertőzés nem lehetséges.
A 21. században aktívan fejlesztik az adenovírus vektorokon alapuló vakcinákat [6] .
A retrovírusok a modern génterápiás megközelítések egyik alapját képezik. A rekombináns retrovírusok, mint például a Moloney-féle rágcsáló leukémia vírus, képesek stabilan integrálódni a gazda genomjába. Reverz transzkriptázt tartalmaznak , hogy létrehozzák az RNS genom DNS-másolatát és az integrázt, amely lehetővé teszi a gazda genomjába való integrációt . Számos, az FDA által jóváhagyott klinikai vizsgálatban alkalmazták, például a SCID-X1 vizsgálatban [7] .
A retrovírus vektorok lehetnek replikációkompetensek vagy replikációhibásak. A replikációhiányos vektorok a legáltalánosabb választás a kutatásban, mivel a vírusok tartalmazzák az extra replikációhoz és a virioncsomagoláshoz szükséges géneket kódoló régiókat, amelyeket más gének helyettesítenek vagy töröltek. Ezek a vírusok képesek megfertőzni a célsejteket és leadni a vírus hasznos terhét, de ezután nem tudják folytatni a tipikus lítikus utat, amely a sejt líziséhez és halálához vezet.
Ezzel szemben a replikáció-kompetens vírusvektorok tartalmazzák a virionszintézishez szükséges összes gént, és tovább szaporodnak, amint a fertőzés megtörténik. Mivel ezeknek a vektoroknak a vírusgenomja sokkal hosszabb, a ténylegesen beépíthető érdeklődésre számot tartó gén hossza korlátozott a replikációhibás vektorok inszertjének lehetséges hosszához képest. A vírusvektortól függően egy érvényes DNS-inszert tipikus maximális hossza egy replikációhiányos vírusvektorban jellemzően 8-10 kB körül van. [8] Bár ez korlátozza számos genomiális szekvencia bevezetését, a legtöbb cDNS-szekvencia még mindig befogadható.
A retrovírusok, például a Moloney retrovírus használatának fő hátránya az, hogy a transzdukcióhoz aktív sejtosztódásra van szükség . Ennek eredményeként a sejtek, például a neuronok nagyon ellenállóak a retrovírusok fertőzéseivel és transzdukciójával szemben.
Aggodalomra ad okot, hogy a gazda genomjába történő integráció miatti inszerciós mutagenezis rákhoz vagy leukémiához vezethet . Ez a probléma elméleti maradt mindaddig, amíg tíz SCID-X1-es beteg génterápiája Maloney egér leukémia vírussal [9] két leukémiás esetet nem eredményezett, amelyet az LMO2 onkogén aktiválása okozott a vektor szoros integrációja miatt. [tíz]
A lentivírusok a retrovírusok egy alosztálya. Néha génterápiás vektorként használják őket, mivel képesek beépülni a nem osztódó sejtek genomjába , ami egyedülálló a lentivírusokra, mivel más retrovírusok csak osztódó sejteket képesek megfertőzni. A vírusgenom RNS formájában reverz transzkripción megy keresztül, amikor a vírus belép a sejtbe, hogy DNS -t termeljen , amelyet aztán véletlenszerűen beillesztenek a genomba (a legújabb eredmények arra utalnak, hogy a vírus DNS beépülése nem véletlen, hanem specifikus aktív génekre irányítja, és a genom szerveződéséhez kapcsolódik [11] ) egy virális integráz enzim . A ma provírusnak nevezett vektor a genomban marad, és osztódáskor továbbadódik a sejt utódainak. Az integrációs oldal kiszámíthatatlan, ami problémát okozhat. A provírus megzavarhatja a sejtgének működését, és rákkeltő onkogének aktiválódásához vezethet , ami aggodalmat kelt a lentivírusok génterápiában való esetleges felhasználásával kapcsolatban. A vizsgálatok azonban kimutatták, hogy a lentivírus vektorok kevésbé hajlamosak beépülni olyan helyekre, amelyek rákot okozhatnak, mint a gamma-retrovirális vektorok. [12] Pontosabban, egy tanulmány kimutatta, hogy a lentivírus vektorok nem okozták sem a daganatok előfordulási gyakoriságának növekedését, sem a daganatok korábbi fellépését olyan egerekben, amelyeknél szignifikánsan magasabb volt a daganatok előfordulása. [13] Ezen túlmenően a mutagén vagy onkológiai események számának növekedését nem figyelték meg azokban a klinikai vizsgálatokban, amelyekben lentivírus vektorokat alkalmaztak a HIV kezelésére szolgáló génterápia megvalósítására.
Biztonsági okokból a lentivírus vektorok soha nem hordozzák a replikációjukhoz szükséges géneket. Lentivírus kinyeréséhez több plazmidot transzfektálnak egy úgynevezett csomagoló sejtvonalba, általában HEK 293 -ba . Egy vagy több plazmid, amelyeket általában csomagoló plazmidoknak neveznek, virionfehérjéket kódol , például a kapszidot és a reverz transzkriptázt . A másik plazmid tartalmazza azt a genetikai anyagot, amelyet a vektor szállítani fog. Átíródik , hogy létrehozza a vírus egyszálú RNS genomját, és a ψ (psi) szekvencia jelenléte jelzi. Ezt a szekvenciát használják a genom virionba csomagolására.
A lentivírusokkal ellentétben az adenovírus DNS nem integrálódik a genomba, és nem replikálódik a sejtosztódás során. Ez korlátozza alkalmazásukat az alapkutatásban, bár az adenovírus vektorokat még mindig használják in vitro kísérletekben és in vivo . [14] Fő felhasználási területük a génterápia és a vakcinázás [15] [16] . Így használják a humán adenovírust a Sputnik V vakcinához. Mivel az emberek gyakran érintkeznek légúti, gyomor-bélrendszeri és szemfertőzéseket okozó adenovírusokkal , a legtöbb beteg már kifejlesztett semlegesítő antitesteket, amelyek inaktiválhatják a vírust, mielőtt az elérné a célsejtet. A probléma megoldása érdekében a tudósok jelenleg olyan adenovírusokat vizsgálnak , amelyek különböző fajokat fertőznek meg, amelyekkel szemben az embernek nincs immunitása.
Az adeno-asszociált vírus (AAV) egy kis méretű vírus, amely megfertőzi az embert és néhány más főemlősfajt. Jelenleg ismert, hogy az AAV nem okoz betegséget, és nagyon gyenge immunválaszt vált ki. Az AAV osztódó és nem osztódó sejteket is képes megfertőzni, és beépítheti genomját a gazdasejt genomjába. Ezenkívül az AAV többnyire episzómális marad (replikáció a kromoszómába való beillesztés nélkül); hosszú és stabil kifejezést valósít meg. [17] Ezek a tulajdonságok teszik az AAV-t nagyon vonzó jelöltté a génterápiás vírusvektorok kifejlesztéséhez. [1] Az AAV azonban legfeljebb 5 KB-ot tud bevinni, ami lényegesen kevesebb, mint az AAV eredeti kapacitása. [17]
Ezen túlmenően, génterápiás vektorként való potenciális felhasználása miatt, a kutatók létrehoztak egy módosított AAV-t, az úgynevezett self-supplementing adeno-asssociated virus (scAAV). Míg az AAV egy DNS-szálat csomagol, és egy második szálszintézis folyamatot igényel, az scAAV mindkét szálat csomagolja, amelyek egymáshoz kapcsolódnak, és kettős szálú DNS-t alkotnak. A második szál szintézisének kihagyásával az scAAV gyors expressziót tesz lehetővé a sejtben. [18] Egyébként az scAAV sok olyan tulajdonsággal rendelkezik, mint az AAV megfelelője.
A hibrid vektorok olyan vektorvírusok , amelyeket genetikailag úgy alakítottak ki, hogy egynél több vektor tulajdonságaival rendelkezzenek. A vírusokat úgy módosították, hogy elkerüljék a tipikus vírusvektorok hiányosságait, amelyek korlátozott terhelési kapacitással, immunogenitással, genotoxicitással rendelkeznek, és nem támogatják a hosszú távú megfelelő transzgénexpressziót . A nem kívánt elemek kívánatos képességekkel való helyettesítésével a hibrid vektorok a jövőben felülmúlhatják a standard transzfekciós vektorokat a biztonság és a terápiás hatékonyság tekintetében. [19]
A genetikai anyag sejtekbe juttatására szolgáló vírusvektor kiválasztása logisztikai problémákkal jár. Terápiás felhasználásra korlátozott számú vírusvektor áll rendelkezésre. E néhány vírusvektor bármelyike immunválaszt válthat ki a gazdaszervezetből, ha a vektort idegen betolakodónak tekintik. [20] [21] Ha egyszer használták, a vírusvektort nem lehet újra hatékonyan használni egy páciensben, mert a szervezet felismeri. Ha egy vakcina vagy génterápia sikertelen a klinikai vizsgálatok során , a vírust a jövőben nem lehet újra felhasználni egy másik vakcina vagy génterápia céljából. Előfordulhat, hogy a páciensben a vírusvektor elleni már meglévő immunitás is jelen van, ami hatástalanná teszi a terápiát az adott beteg számára. [20] [22] Lehetséges a már meglévő immunitás ellensúlyozása, ha vírusvektort használnak vakcinázáshoz , ha nem vírusos DNS-vakcinával kezdik el , de ez a módszer egy másik problémát és akadályt jelent az oltóanyag elosztási folyamatában. [23] A meglévő immunitást a vakcina dózisának növelésével vagy az oltási mód megváltoztatásával is meg lehet támadni . [24] A vírusvektorok néhány hátránya (mint például a genotoxicitás és az alacsony transzgénexpresszió) leküzdhető hibrid vektorok használatával.