Oligonukleotidok szintézise

Az oligonukleotidok szintézise adott kémiai szerkezetű (szekvenciájú) nukleinsavak  viszonylag rövid fragmenseinek kémiai szintézise . A módszert a modern laboratóriumi gyakorlatban alkalmazzák a kívánt szekvenciájú oligonukleotidok gyors és olcsó kinyerésére.

Az oligonukleotidok szintézisének legelterjedtebb módszere amidofoszfitokon alapul  , amelyek építőelemek dezoxiribonukleozidok ( dA , dC , dG , T ) vagy ribonukleozidok ( A , C , G , U ) reaktív származékai, és lehetővé teszik a a DNS és az RNS rövid fragmentumai . Más amidofoszfitokat is használnak, amelyek lehetővé teszik módosított nukleozidok, különféle jelölések és funkciós csoportok bejuttatását a termékláncba . A szintézis során ezeket a reagenseket felváltva, a céltermék sorrendje által meghatározott sorrendben adják hozzá a szilárd fázisú hordozón növekvő lánchoz . Ezt a folyamatot az 1970-es évek végén teljesen automatizálták, és jelenleg dedikált számítógép-vezérelt szintetizátorokban hajtják végre.

A szintézis befejezése után az oligonukleotidot elválasztjuk a hordozótól, eltávolítjuk a szintézis során használt védőcsoportokat , és a kapott terméket elektroforézissel vagy HPLC -vel tisztítjuk .

A szintetikus oligonukleotidokat széles körben használják a molekuláris biológiában és az orvostudományban, például antiszensz oligonukleotidokként, DNS-szekvenáláshoz és -amplifikációhoz szükséges primerekként , komplementer DNS- és RNS-szekvenciák meghatározására szolgáló próbák , mutációk és restrikciós helyek célzott bevezetésének eszközei , valamint mesterséges gének .

Történelem

Az oligonukleotid-szintézis evolúciója során négy fő módszert fejlesztettek ki a nukleozidok közötti kötések létrehozására . Ezeket a módszereket részletes irodalmi áttekintések tárgyalják [1] [2] [3] .

Korai munka és a modern H-foszfonát módszer

Az 1950-es évek elején Alexander Todd cambridge -i csoportja lefektette az oligonukleotidok szintézisére szolgáló H-foszfonát és foszfotriészter módszerek alapjait [ 4] [5] védett klórfoszfát 4 szintetizálásával, majd 3' -védett timidinnel és timidinnel történő reagáltatásával. a kapott védett 6 -os dinukleotid szerkezetének megerősítése enzimatikus hasítással. Furcsa módon Cambridge-ben nem folyt további ilyen irányú munka (Todd önéletrajzában megjegyezte, hogy az oligonukleotidok szintézise nem vonzotta) [1] .

Todd munkásságához csak harminc évvel később térhetett vissza, amikor két kutatócsoport a H-foszfonát kondenzációt szilárd fázisú szintézishez igazította , építőelemként nukleozid -H-foszfonátokat és pivaloil-kloridot , 2,4,6-triizopropil-benzolszulfonil-kloridot (TIPS-) Cl) és más vegyületek - aktivátorként [6] [7] . A gyakorlatban az eljárást egyszerű szintetikus ciklusként szervezték meg, amely két lépésből állt: a dimetoxi-tritil védelem eltávolítása és a kondenzáció.

A nukleozidok közötti H-foszfonát-diészter kötés oxidációját ennél a módszernél az oligonukleotid lánc szintézise után hajtjuk végre, jód vizes piridinben készült oldatának hatására . Szükség esetén az oxidációt vízmentes környezetben is elvégezhetjük [8] . A módszer lehetővé teszi az oligonukleotidok tiofoszfát [9] és szelenofoszfát [10] analógjainak szintetizálását is. A szén-tetrakloriddal végzett oxidáció primer és szekunder aminok jelenlétében amidofoszfát analógokhoz vezet [11] [12] .

Általános szabály, hogy a nukleozidok összes 3'-H-foszfonátjában az 5'-hidroxilcsoportot és az A, G és C bázisú nukleozidok H-foszfonátjaiban az aminocsoportot ugyanazok a csoportok védik a szintézisben történő felhasználás előtt, mint amidofoszfit módszerrel . Az aminocsoportok védelme azonban nem feltétlenül szükséges [8] [13] .

Foszfodiészter módszer

Az 1950-es években Har Gobind Korana és munkatársai kifejlesztettek egy foszfodiészter módszert, amelyben a 3'- O -acetilnukleozid-5'- O - foszfátot N , N'- diciklohexil -karbodiimiddel (DCC) vagy p -toluolszulfonil-kloriddal ( TsCl ) aktiválták. majd egy 5'- O - védett nukleoziddal injektálva dinukleozid-monofoszfátot képeznek [14] . A bázikus közegben lévő védőacetilcsoport eltávolítása után további lánchosszabbítást végeztünk. A tri- és tetramer oligonukleotid készleteket lépcsőzetes kondenzációval szintetizáltuk. Ezenkívül az oligomer fragmensek kondenzációját is elvégezték, hogy hosszabb oligonukleotidokat kapjanak [1] .

A foszfátcsoportok védelmét a foszfodiészter szintézisben nem alkalmazták, és ez láthatóan mellékreakciókhoz vezetett, és csökkentette a szintézis hozamát. Korana azonban úgy vélte, hogy a foszfátcsoportok védelme az oligonukleotidok fő előnyének elvesztéséhez vezetne: polielektrolit természetükhöz, amely – véleménye szerint – hatékonyan használható az oligonukleotidok tisztítására. A Korán fontos felfedezése a tritil védőcsoportok alkalmazása az 5'-hidroxil-nukleozidok védelmére [1] .

Foszfotrieter módszer

Az 1960-as években R. Letsinger ( eng.  R. Letsinger ) [15] [16] és K. Reese ( ing.  C. Reese ) [17] vezette csoportok kidolgozták a foszfotriészter módszert. A meghatározó különbség a foszfodiészter megközelítéstől a reagensben és a termékben lévő foszfát előzetes védelme a -CH 2 CH 2 CN cianoetilcsoporttal. Ez a változás kiküszöbölte az oligonukleotidok elágazásának lehetőségét a foszfátcsoportoknál. A módszer nagyobb szelektivitása lehetővé tette reaktívabb kondenzáló reagensek és katalizátorok alkalmazását [18] [19] , ami jelentősen csökkentette a szintézis időtartamát. A foszfotriészter módszert mind oldatban, mind szilárd fázisban megvalósították [1] .

Ezzel a módszerrel sikerült szintetizálni két, 77 és 104 bázispár hosszúságú kétszálú oligonukleotidot, amelyek szekvenciája megfelelt az inzulin A- és B-láncának , ami később lehetővé tette ezen gének sikeres expresszióját [1] .

Foszfit-triészter módszer

Az 1970-es években bevezették a gyakorlatba az internukleozid kötések kialakítására szolgáló foszfit-triészter módszert, amelyben sokkal reaktívabb P(III) alapú nukleozid származékokat, eredetileg klorofoszfitokat alkalmaztak [20] . Később egy M. Caruthers vezette csoport kevésbé agresszív és szelektívebb 1 H -tetrazolid-foszfitokat használt , és a módszert szilárd fázisú változatban valósította meg [21] . Röviddel ezután az azonos csoporthoz tartozó alkalmazottak a stabilabb nukleozid amidofoszfitok építőelemként való felhasználásával javították a módszert . A kevésbé praktikus metil-foszfát védőcsoport [22] [23] [24] helyettesítése a kényelmesebb 2-ciano-etil-csoporttal [25] a nukleozid-amidofoszfitok változatát eredményezte, amely ma is az oligonukleotidok szintézisének standard reagense. A monomer blokkok szintetizálására szolgáló módszerek, az oligonukleotid szintetizátorok, valamint az összeállítási és blokkolási protokollok számos további fejlesztése az amidofoszfit megközelítést egy nagyon megbízható és produktív módszerré változtatta szintetikus oligonukleotidok előállítására [26] .  

Szintézis amidofoszfit módszerrel

Építőelemek

Nukleozid-amidofoszfitok

1976-ban Letsinger és munkatársai megállapították, hogy a háromértékű foszforvegyületek sokkal aktívabb reagensek, mint a megfelelő ötértékű foszforszármazékok. A P(III)-vegyületek szerepe azután vált nyilvánvalóvá, hogy M. Carruthers kifejlesztette a nukleozidok N,N- diizopropilamid-foszfit származékait ( nukleozid-amidofoszfitokat ) [1] [22] , amelyek máig az amid standard építőköveit töltik be. foszfit szintézis módszer ma. A nem kívánt mellékreakciók elkerülése érdekében az amidofoszfitok funkciós csoportjait védőcsoportokkal kell blokkolni . Miután az oligonukleotid lánc összeállítása befejeződött, az összes védőcsoportot eltávolítjuk, ami a cél oligonukleotidot eredményezi. Az alábbiakban a kereskedelemben kapható standard nukleozid amidofoszfitokban használt védőcsoportok láthatók [27] :

  • Az 5'-helyzetben lévő hidroxilcsoportot 4,4'-dimetoxi-tritil (DMT) védőcsoport védi, amelyet savas körülmények között eltávolítanak.
  • A timin és az uracil , a timidin és az uridin nitrogéntartalmú bázisai nem tartalmaznak exociklusos aminocsoportokat, így nincs szükségük védőcsoportokra. A guanin alacsony bázikusságú exociklusos aminocsoporttal rendelkezik , így nem lép reakcióba amidofoszfitokkal kondenzációs reakciókörülmények között. Azonban az N2-vel nem védett 5' - O -DMT-2'-dezoxiguanozinon alapuló amidofoszfit reagens rosszul oldódik az acetonitrilben  , az oligonukleotidok szintézisében leggyakrabban használt oldószerben. Éppen ellenkezőleg, ugyanazon vegyület N2-védett származékai jól oldódnak acetonitrilben, ezért sokkal szélesebb körben használják őket. Az adenin és citozin nitrogéntartalmú bázisok aminocsoportokat tartalmaznak, amelyek reakcióba léphetnek amidofoszfitokkal a szintézis során, ezért ezeket a csoportokat védeni kell a szintézishez standard körülmények között. Mindazonáltal további lépések beiktatásával a szintetikus ciklusba elérhetővé válik a dA és dC nem védett amidofoszfitok alkalmazása [28] . A nitrogéntartalmú bázisokon lévő védőcsoportokat a szintézis során végig meg kell őrizni, ezért olyan csoportokat használunk, amelyek reakcióképessége ellentétes a 4,4'-dimetoxi-tritil-csoport reakcióképességével, amelyet minden ciklus után eltávolítanak. Az alábbiakban a két leggyakrabban használt megközelítést ismertetjük.
    • Az első, standard megközelítésben benzoil-védelmet (Bz) alkalmaznak az adenin és citozin védelmére , míg a guanint egy izobutiril-csoport ( i Bu) védi [29] . Később egy acetil (Ac) csoportot javasoltak a citozin védelmére , amely ammóniával vagy ammónia és metil -amin keverékével eltávolítható [30] .
    • A második, enyhébb védelmi rendszerben az adenint izobutiril [31] vagy fenoxiacetil (PAC) [32] csoportok védik. A citozin acetil-védőcsoportot tartalmaz [30] , míg a guanint 4-izopropil-fenoxi-acetil- ( i Pr-PAC) [33] vagy dimetil-formamidin (dmf) [34] csoportok védik. A lágy védőcsoportok könnyebben eltávolíthatók, mint a standardok, azonban az ilyen csoportokat tartalmazó amidofoszfitok kevésbé stabilak oldatban tárolva.
  • A foszfitcsoportot 2-ciano-etil-csoport védi [25] . A foszfitvédelem jelenléte kötelező amidofoszfit és az újonnan képződött foszfit-triésztercsoport esetében, mielőtt az utóbbi foszfotriészterré oxidálódik. Ugyanakkor a már összeállított oligonukleotid fragmens foszfátcsoportjain védelem jelenléte nem szükséges a további sikeres kondenzációs ciklusokhoz [35] .
  • Az RNS - szintézis olyan építőelemeket használ, amelyekben egy "extra" 2'-hidroxilcsoport nem vesz részt a szintézisben. Terc -butil-dimetil- szilil- (TBDMS) [36] [37] [38] vagy triizopropil-szilil-oxi-metil (TOM) [39] [40] csoporttal van védve . Mindkét csoport fluoridion hatására eltávolítható .
  • A foszfitcsoport tartalmaz egy diizopropil-amin csoportot ( i -Pr 2 N), amely savas körülmények között reakcióképes. Savas katalizátor hatására ezt a csoportot a növekvő lánc 5'-hidroxilcsoportja váltja fel [22] .
Nem nukleozid amidofoszfitok

A nem nukleozid amidofoszfitok olyan amidofoszfit reagensek, amelyeket arra terveztek, hogy különféle funkcionális csoportokat és jelöléseket vezessenek be egy oligonukleotid terminális pozíciójába vagy egy szekvencia közepén lévő nukleotidmaradékok közé. Ahhoz, hogy alkalmas legyen a lánc közepébe történő bejuttatásra, az amidofoszfitnak legalább két hidroxilcsoportot kell tartalmaznia, amelyek közül az egyik DMT-csoporttal védett, a másik pedig reaktív amidofoszfitcsoportot tartalmaz.

A nem nukleozid amidofoszfitokat arra használják, hogy az oligonukleotidba olyan csoportokat vigyenek be, amelyek nem találhatók meg a természetes nukleozidokban. Hasonló reagensek széles skáláját szintetizálták, amelyek például 5'-foszfát [41] , aminocsoport [42] , merkaptocsoport [ 43] , aldehid [44] és karboxil [45] bevitelére szolgálnak , alkinfragmensek [46] , fluoreszcens festékek [47] és kioltók, hidrofil [48] és hidrofób [49] módosítások, biotin [50] stb.

Szintetikus ciklus

Az oligonukleotidok szintézisét az építőelemek fokozatos kondenzációjával hajtják végre a növekvő lánc 5'-végéhez, amíg a célszekvencia össze nem áll. A mellékreakciók előfordulása korlátozza a szintetizált oligonukleotid hosszát (legfeljebb 200 nukleotid ), mivel a hibák száma a céltermék hosszának növekedésével halmozódik [26] . A lánc egy nukleotiddal való meghosszabbításához szükséges műveletek sorozatát szintézisciklusnak nevezzük, és négy kémiai reakcióból áll.

1. szakasz: A tritil védelem eltávolítása

A DMT-védőcsoportot savas oldattal, például 2%-os triklór-ecetsavval vagy 3%-os diklór-ecetsavval távolítjuk el inert oldószerben ( metilén-klorid vagy toluol ). A kapott narancssárga dimetoxi-tritil-kationt kimossuk a rendszerből. Ennek eredményeként egy szilárd fázisú hordozón rögzített szabad 5'-hidroxilcsoporttal rendelkező oligonukleotid prekurzor képződik. A folyamat huzamosabb ideig tartó végrehajtása vagy töményebb savoldatok alkalmazása egy mellékreakcióhoz, a depurinációhoz vezet  – a purinbázisok eltávolításához a ribózmaradékból .

2. szakasz: Kondenzáció

Nukleozid amidofoszfit (0,02–0,2 M) oldatát vagy több amidofoszfit acetonitriles keverékét 0,2–0,7 M azol alapú savas katalizátorral aktiválják : 1 H - tetrazol , 2-etiltiotetrazol [21] , , . -benziltiotetrazol [52] , 4,5-dicianimidazol [53] stb. A komponensek keveredése a szintetizátor kommunikációs vezetékeiben történik a reagenseknek a szilárd fázisú hordozót tartalmazó reaktorba történő szállítása során. 1,5-20-szoros feleslegben aktivált amidofoszfit kerül kölcsönhatásba az 5'-hidroxil-csoporttal, és így foszfit-triészter kötés jön létre. A 2'-dezoxinukleozidok amidofoszfitjainak kondenzációja nagyon gyorsan megy végbe, és kis léptékben általában körülbelül 20 másodpercet vesz igénybe. A ribonukleozidok sztérikusan gátolt amidofoszfitjai sokkal lassabban (5-15 perc) reagálnak [54] [55] [56] [57] . A reakció igen érzékeny a víz jelenlétére, különösen híg amidofoszfit oldatok esetén, ezért vízmentes oldószerben, általában acetonitrilben hajtjuk végre . A szintézis léptékének növekedésével kisebb feleslegeket és koncentráltabb amidofoszfit oldatokat használnak. A reakció befejeződése után a felesleges reagenseket és a melléktermékeket mosással eltávolítjuk a reaktorból.

3. szakasz: Korlátozás

A lezárást úgy végezzük, hogy egy szilárd fázisú hordozót ecetsavanhidrid és 1-metil-imidazol (ritkábban DMAP ) keverékével kezelünk katalizátorként . Az amidofoszfit szintézisen belül ez a lépés két célt szolgál:

  • A kondenzációs szakasz befejeződése után az 5'-hidroxilcsoportok kis része (0,1-1%) reagálatlanul marad, és el kell távolítani a további lánchosszabbítás folyamatából, hogy megakadályozzuk a hiányzó nukleotid-maradékokkal rendelkező oligonukleotidok képződését. a lánc. Ebből a célból a fennmaradó hidroxilcsoportokat acetilcsoportokkal védik, amelyek ellenállnak a DMT-védelem eltávolítására használt savas oldatoknak.
  • Arról is beszámoltak, hogy az 1 H -tetrazollal aktivált amidofoszfitok kis hozammal reagálnak a guanozin O 6 pozíciójában lévő karbonil-oxigénnel [58] . Ha jód és víz keverékével oxidálják , ez a melléktermék a purinbázis lehasad . A kapott apurin helyek könnyen hidrolizálódnak az oligonukleotid végső védőcsoport-eltávolítása során, ami két rövidebb oligonukleotid képződéséhez és a céltermék hozamának csökkenéséhez vezet. Az O 6 módosítások gyorsan eltávolíthatók egy lezárószer hatására, ha a lezárást az oxidációs lépés előtt hajtják végre.
4. szakasz: Oxidáció

A kondenzáció eredményeként kapott internukleozid háromkoordinált foszfitcsoport nem természetes, és szintézis körülményei között korlátozott a stabilitása. A hordozót jóddal és vízzel gyenge bázis ( piridin , 2,6-lutidin vagy kollidin ) jelenlétében kezelve a foszfit foszfotriészterré oxidálódik, amely a természetes foszfodiészter internukleozid kötés prekurzora. Az oxidációt vízmentes körülmények között is végrehajthatjuk terc-butil-hidroperoxid [59] vagy egy kényelmesebb reagens, ( 1S )-(+)-(10-kámforszulfonil)oxaziridin [60] alkalmazásával .

Szilárdtest-hordozók

A szilárd fázisú szintézis során az oligonukleotid kovalensen kötődik a szilárd fázisú hordozóhoz a 3'-hidroxilcsoporton keresztül. A hordozót általában oszlopokban helyezik el, amelyek mérete a szintézis léptékétől függ. Az elmúlt 10 évben elterjedtek a nagy teljesítményű oligonukleotid szintetizátorok, amelyekben a hordozót a lemez lyukaiba helyezik (lemezenként 96 vagy 384 lyuk) [61] . A szintézis befejezése után az oligonukleotid lehasad a hordozóról, és oldatba kerül.

Médiaanyag
CPG pórusméret, Å [62] Töltés,
µmol/g		 Termék hossza,
alapjai
500 80-90 <50
1000 50-60 80
1500 35-45 100
2000 20-30 150
3000 200

A szerves szilárd fázisú szintézissel és a peptidszintézissel ellentétben az oligonukleotid szintézis jobban megy végbe nem duzzadó vagy gyengén duzzadó szilárd fázisú hordozókon. A leggyakrabban használt hordozók a szabályozott pórusú üveg (CPG) és a makroporózus polisztirol (MPPS) [ 63] . 

  • A CPG fő jellemzője a pórusátmérő , amely 70 és 4000 Å között lehet , miközben a pórusok mérete nagyon egyenletes (a pórusok 80%-ánál az eltérés ±10%). Ahhoz, hogy egy ilyen hordozót szintézisre alkalmassá tegyünk, (3-aminopropil) -trietoxi-szilánnal (APTES) kezeljük, így aminopropil-CPG-t kapunk. Gyakran használják a hosszú láncú aminoalkil-CPG -t , az LCAA CPG- t  is [63] . A szintézis két fő jellemzője a pórusmérettől függ: a skála, amelyet a hordozó tömegegységére eső aktív funkciós csoportok száma határoz meg, és a szintetizált oligonukleotid maximális hossza. A leggyakoribb CPG-hordozókra vonatkozó adatokat a [62] táblázat tartalmazza .
  • Az oligonukleotidok szintézisében is makropórusos polisztirolt használnak, amelyet sztirol és divinil -benzol kopolimerizálásával nyernek , a bevezetett aminometil-módosítással. Ez a polisztirol 40-50 bázisnál rövidebb oligonukleotidok szintetizálását teszi lehetővé. Kis szintézisekhez polisztirol hordozó használható 10-45 µmol/g töltettel. A 25–100 µmol-os szintézisekhez polisztirolt használnak 200–400 µmol/g terheléssel. Végül a polisztirol alkalmasabb, mint a CPG nagyméretű (100 µmol-nál nagyobb) szintézisekhez [62] .
Linker kémia

Az oligonukleotid szintézis céljából nukleozid-szukcinátokat vagy nem nukleozid linkereket kovalensen kapcsolnak az aminopropil-CPG, LCAA CPG vagy aminometil-MPPS aminocsoportjaihoz. Általában három különböző típusú adathordozót használnak.

  • Nukleozid hordozók . A történetileg első megközelítésben egy oligonukleotid szintézisét egy hordozón hajtják végre, amelyhez egy 3'-terminális starter nukleozid kovalensen kapcsolódik előre egy borostyánkősav fragmensen keresztül. Ennek megfelelően a szintézis egy amidofoszfit hozzáadásával kezdődik, amely nem az első, hanem a második nukleotidnak felel meg, a 3'-végtől számítva. Az ilyen hordozó hátránya, hogy a szintézis megkezdése előtt ki kell választani a szintetizált oligonukleotidban a 3'-terminális nukleozidnak megfelelő nukleozid hordozó variánst, ami csökkenti a szintetikus folyamat termelékenységét és növeli az emberi hiba valószínűségét. [64] . Alternatív, diglikol- és oxálsav alapú távtartóval ellátott szilárd fázisú hordozókat is javasoltak a termék gyorsabb elválasztására a hordozótól [63] .
  • Univerzális média . Ennél a módszernél a szintézis egy univerzális hordozóval kezdődik, amelyhez egy nem nukleozid linkert kapcsolnak [65] . Az amidofoszfit, amely a 3'-terminális nukleozidnak felel meg, az univerzális hordozóhoz kötődik standard módszerek szerint az első szintetikus ciklus során. Ezt követően folytatjuk a kívánt szekvencia összeállítását, majd az oligonukleotidot lehasítjuk a hordozó felületéről. Ennek a megközelítésnek az az előnye, hogy minden szintézisben, függetlenül attól, hogy melyik szekvenciát kell szintetizálni, egyetlen univerzális hordozó használható [64] .
  • Speciális hordozókat használnak arra, hogy a szintetikus oligonukleotidok 3'-helyzetéhez kapcsoljanak valamilyen funkcionális vagy riportercsoportot. Kereskedelmi forgalomban kapható hordozók aminocsoportok [66] , merkaptocsoportok [ 67] , fluoreszcencia kioltók [68] stb.

A tiofoszfát-oligonukleotidok és szintézisük

A tiofoszfát oligonukleotidok olyan módosított oligonukleotidok, amelyekben a foszfátmaradékban az egyik oxigénatomot kénatom helyettesíti . Csak azokat a tiofoszfátokat használják széles körben, amelyekben a kén nem kapcsolódik a nukleozid-maradék és a foszforatom között. Ebben az esetben az oxigén kénnel való helyettesítése új kiralitási centrum kialakulásához vezet a P (V) atomon, ezért a legegyszerűbb dinukleotid esetében S P - és RP - diasztereomerek képződnek . Egy n -mer oligonukleotidban, amelyben az összes ( n - 1) internukleotid kötés tiofoszfát, a diasztereomerek száma 2 ( n - 1) . A nukleinsavak nem természetes analógjaiként az oligonukleotid-tiofoszfátok lényegesen jobban ellenállnak a nukleázok általi hidrolízisnek, amely az enzimek egy osztálya , amely a foszfodiészter-híd PO-kötésének hidrolízisével hasítja a nukleinsavakat. Ez a tulajdonság határozza meg a tiofoszfátok antiszensz oligonukleotidként való alkalmazását in vivo és in vitro alkalmazásokban , ahol a nukleázoknak való kitettség elkerülhetetlen. Hasonlóképpen, a kis interferáló RNS -ek stabilitásának növelése érdekében gyakran legalább egy tiofoszfát kötést visznek be a szensz és antiszensz szálak 3'-helyzetébe. Az optikailag tiszta oligonukleotid- tiofoszfátokban azok a diasztereomerek, amelyekben minden foszforcentrum SP konfigurációjú , jobban ellenáll az enzimes hidrolízisnek, mint RP megfelelőik . Az optikailag tiszta tiofoszfátok szintézise azonban nehéz [69] [70] .

Az oligonukleotid-tiofoszfátok szintézise hasonló a természetes oligonukleotidok szintéziséhez. A különbség az, hogy az oxidációs lépést egy kénezési reakció váltja fel. A következő kereskedelmi forgalomban kapható reagenseket használják a kén bejuttatására:

  • A 3-(Dimetilaminometilidén-amino)-3H-1,2,4-ditiazol-3-tion ( DDTT ) nagy kénezési sebességet biztosít, és oldatban stabil [71] .
  • A Beaucage  Reagent jobban oldódik acetonitrilben , és lehetővé teszi, hogy a reakció rövidebb idő alatt lezajlik . Oldatban azonban korlátozott a stabilitása, és kevésbé hatékony az RNS-kötések kénezésében [72] .
  • Az N,N,N',N'-tetraetil-tiurám-diszulfid ( TETD ) acetonitrilben oldódik, azonban a DNS internukleozid kötésének kénezésének reakciója 15 percet vesz igénybe, ami 10-szer lassabb, mint az előző két vegyület esetében . 73] .

Más kénező reagenseket is kifejlesztettek [74] .

A tiofoszfát-oligonukleotidok szintézisében a lezárási lépést a kénezés után hajtják végre. Ha a lezárást a kénezés előtt végezzük, akkor a lezárás után a szilárd fázisú hordozó ecetsavanhidridet és 1-metil-imidazolt tartalmazhat. A fedőelegy gátolja a kénátviteli reakciót, ami megnövekedett foszfátegység-tartalmú tiofoszfát oligonukleotidok képződéséhez vezet. Ebben az esetben a kénezési reakció után javasolt a lezárást elvégezni [71] .

Automatizálás

Korábban az oligonukleotid szintézist manuálisan végezték oldatban vagy szilárd fázison. A szilárd fázisú szintézishez különféle porózus membrános fecskendő vagy miniatűr üvegszűrő alapú eszközöket adaptáltak, amelyek lehetővé teszik a szilárd fázisú hordozó reagens oldatokkal történő mosását és vákuum segítségével történő eltávolítását [76] .

Jelenleg a szilárd fázisú szintézis automatikusan, számítógéppel vezérelt oligonukleotid szintetizátorokban történik. Ezek az eszközök egy sor szelepből állnak, amelyek a reagenstartályokhoz vannak csatlakoztatva, valamint mágnesszelepekből , amelyek nyitják vagy zárják az egyik vagy másik szelepet. A mágnesszelepeket viszont a szintézis programot futtató számítógép vezérli. Amikor a szelep nyitva van, a szilárd fázisú hordozót tartalmazó oszlopon egy bizonyos reagenst pumpálnak át a program által meghatározott ideig. A reagens adagolásának ideje és sorrendje minden szintézis futtatásakor állandó; az egyetlen változó a monomer reagens, amelyet egy adott ciklusban kondenzálni kell. Kiválasztását is a program a megadott oligonukleotid szekvenciának megfelelően végzi [77] .

A szintézis megvalósítható oszlop, lemez vagy chip formátumban. Az oszlopos szintézis módszer alkalmas ezen polimerek kutatására, vagy nagy léptékű szintézisére, ahol nincs szükség nagy áteresztőképességű szintézisre. A lemezformátumot kifejezetten nagy áteresztőképességű, kis léptékű szintézisre tervezték, hogy megfeleljen a szintetikus oligonukleotidok iránti növekvő ipari és tudományos igényeknek. Különféle szintetizátorok kaphatók a kereskedelemben [78] [79] [80] .

Szintetikus utófeldolgozás

A céloligonukleotid megszerzéséhez el kell távolítani az oligonukleotid összes védőcsoportját :

  • egy 5' DMT csoport;
  • nitrogénbázisú acil-védőcsoportok;
  • 2-ciano-etil-csoportok, amelyek védik az internukleozid-foszfát-csoportokat.

Az 5'-DMT csoportot általában savas oldattal távolítják el az automatikus szintézis során. Az oligonukleotid lehasítása a hordozóról, a bázisok és a ciano-etil-védőcsoportok védőcsoportjainak eltávolítása általában egyidejűleg történik szervetlen bázisok vagy aminok hatására . Általában vizes ammóniát , metil- amin oldatát , ezek keverékeit [30] , gázhalmazállapotú ammóniát vagy metil-amint [81] , ritkábban más primer aminok és lúgok szoba- vagy emelt hőmérsékletű oldatait használják. Ez a kezelés eltávolítja az összes védőcsoportot a 2'-dezoxi-oligonukleotidokról, így a végtermék oldata marad. A 2'- O -szilil-védett oligoribonukleotidok esetében egy lépést adunk a szilil-védőcsoportok eltávolítására fluoridion hatására [82] .

Ennek a módszernek az alkalmazását korlátozza az a tény, hogy a feldolgozás során akrilnitril keletkezik melléktermékként . A védőcsoport eltávolítása mellett az akrilnitril nitrogénbázisokat alkilezhet, főként a timin és uracil N3-helyzetét, így a Michael-reakcióval 2-ciano-etil-származékok keletkeznek . Ezeknek a melléktermékeknek a képződése elkerülhető, ha a szilárd fázisú hordozóhoz kötött oligonukleotidokat bázisok szerves oldószeres oldatával, például acetonitrilben oldott 50%-os trietil-aminnal [83] vagy acetonitriles 10 % -os dietil - aminnal [ 84] készült oldatával kezeljük .

A nem védett oligonukleotid további tisztítás nélkül használható, vagy tovább tisztítható az alábbi módszerek egyikével [85] .

  • Az oligonukleotid tisztításának legdurvább módszere a sómentesítés, azaz a védőcsoportok ( benzamid , izobutiramid , ammónium-acetát stb.) eltávolítása során keletkező kis molekulatömegű szennyeződések elválasztása . Nagy mennyiségű oligonukleotid esetén a sómentesítést kényelmesen etanolos kicsapással végezzük : ebben az esetben a termék kicsapódik, miközben a szennyeződések és bizonyos esetekben rövidebb oligonukleotidok az oldatban maradnak. Kis mennyiségeknél gélszűrést alkalmaznak [86] .
  • A csonkolt oligonukleotidok tisztítása hatékonyan végezhető poliakrilamid gélelektroforézissel , amely az oligonukleotidok méret szerinti szétválasztásán alapul, mivel eltérő mobilitásuk van a gélben elektromos tér hatására. Ultraibolya abszorpciós elektroforézis után meghatározzuk a céloligonukleotidot tartalmazó gélfragmenst, ezt a részt kivágjuk, és a tisztított oligonukleotidot áztatással vagy elektroelúcióval izoláljuk [87] .
  • A legteljesebb tisztítás nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) érhető el. Ebben a módszerben az elválasztás az oligonukleotidok hidrofób (fordított fázisú HPLC) vagy töltés (ioncserélő HPLC) kölcsönhatásán alapul. Ennek a kölcsönhatásnak az erőssége befolyásolja a termék kromatográfiás oszlopról való eluálásának sorrendjét és idejét, ami lehetővé teszi a különböző hosszúságú termékek hatékony elkülönítését. Gyakran alkalmaznak egy alternatív megközelítést, amelyben az oligonukleotid 5'-DMT-csoportját nem távolítják el a tisztítás előtt. Ebben az esetben a hidrofób védőcsoport jelenléte miatt jelentősen megnő annak hidrofóbsága és a hidrofób szorbenssel való kölcsönhatás erőssége, és csökken a kromatográfiás mobilitás, ami hatékonyabbá teszi a termékizolálást. A DMT-csoportot ezután savas közegben eltávolítjuk, az oldatot bepároljuk és sótalanítjuk [88] .

Jellemzés

Más szerves anyagokhoz hasonlóan hasznos az oligonukleotid jellemzése az előállítás után. Bonyolultabb esetekben (kutatás vagy nagy léptékű szintézis) ez kétszer történik: a védőcsoport eltávolítása és tisztítás után. Bár a leghelyesebb megközelítés egy oligonukleotid jellemzésére a szekvenálás , amely egy viszonylag olcsó és rutin eljárás, gazdasági megfontolások megakadályozzák, hogy bekerüljön az oligonukleotid termelésbe. A napi gyakorlatban elegendő egy oligonukleotid molekulatömegét a tömegspektrumának rögzítésével meghatározni . A tömegspektrometriának két módszerét alkalmazzák: az elektrospray -t és a MALDI tömegspektrometriát. Az informatív spektrum megszerzéséhez fontos, hogy a mintában előforduló összes fémiont ammónium- vagy trialkil-ammóniumionokra cseréljük.

  • Elektrospray-vel ionizálva egy oligonukleotid ionkészletet hoz létre, amely megfelel a vegyület különböző ionizációs fokának. Egy M molekulatömegű oligonukleotid ( M -  n H ) / n tömegű ionokat ad , ahol M  az oligonukleotid molekulatömege sav formában (a foszfodiészter kötések összes negatív töltését protonok jelenléte kompenzálja)  , n az ionizáció foka, H a hidrogénatom atomtömege (1 Igen). Jellemzésére leginkább a 2 és 5 közötti n értékkel rendelkező ionok a leghasznosabbak.A modern műszerekkel szállított szoftver képes automatikusan megkeresni egy adott oligonukleotidhoz tartozó ioncsúcsokat, és kiszámítani az utóbbi molekulatömegét.
  • Az oligonukleotidokban lévő szennyeződésekkel kapcsolatos részletesebb információk megszerzéséhez olyan analitikai módszereket alkalmaznak, amelyek kombinálják a HPLC-t és a tömegspektrometriát [89] vagy a kapilláris elektroforézist és a tömegspektrometriát [90] .

Lásd még

Jegyzetek

  1. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Reese CB Oligo- és polinukleotidok: 50 év kémiai szintézis   // Org . Biomol. Chem. - 2005. - 20. évf. 3 , sz. 21 . - P. 3851-3868 . doi : 10.1039 / b510458k . — PMID 16312051 .
  2. ↑ Brown DM Az oligonukleotid szintézis rövid története // Protocols for Oligonucleotids and Analogs: Synthesis and Properties. - Springer, 1993. - P. 1-17. — (Módszerek a molekuláris biológiában). - doi : 10.1385/0-89603-281-7:1 .
  3. ↑ Iyer RP, Beaucage SL 7.05 Oligonukleotid szintézis // Comprehensive Natural Products Chemistry. - Elsevier, 1999. - P. 105-152.
  4. ↑ Michelson AM, Todd AR Nucleotides part XXXII. 3′:5′-internukleotid kötést tartalmazó ditimidin-dinukleotid szintézise  (angol)  // J. Chem. szoc. - 1955. - P. 2632-2638 . - doi : 10.1039/JR9550002632 .
  5. ↑ Hall RH, Todd A., Webb RF 644. Nukleotidok. rész XLI. Vegyes anhidridek, mint intermedierek dinukleozid-foszfátok szintézisében  //  J. Chem. szoc. - 1957. - P. 3291-3296 . - doi : 10.1039/JR9570003291 .
  6. ↑ Froehler BC, Ng PG, Matteucci MD DNS szintézise dezoxinukleozid H-foszfonát köztitermékeken keresztül   // Nucl . Acids Res. - 1986. - 1. évf. 14 , sz. 13 . - P. 5399-5407 . doi : 10.1093 / nar/14.13.5399 . Archiválva az eredetiből 2022. május 6-án.
  7. ↑ Garegg PJ, Lindh I., Regberg T., Stawinski J., Strömberg R. Nucleoside H-phosphonates. III. Oligodezoxiribonukleotidok kémiai szintézise hidrogén-foszfonátos megközelítéssel  (angol)  // Tetrahedron Lett. - 1986. - 1. évf. 27 , sz. 34 . - P. 4051-4054 ​​. - doi : 10.1016/S0040-4039(00)84908-4 .
  8. ↑ 1 2 Wada T., Sato Y., Honda F., Kawahara S., Sekine M. Oligodezoxiribonukleotidok kémiai szintézise N-védetlen H-foszfonát monomerek és karbon- és foszfóniumkondenzáló reagensek felhasználásával: O-szelektív és foszfonizálás .Amer. Chem. szoc. - 1997. - T. 119 , 52. sz . - S. 12710-12721 . - doi : 10.1021/JA9726015 .
  9. ↑ Agrawal S., Tang JY Oligoribonukleotid és foszforotioát analógjának hatékony szintézise H-foszfonát megközelítéssel // Tetrahedron Lett. - 1990. - T. 31 , 52. sz . - S. 7541-7544 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)97293-9 .
  10. ↑ Tram K., Wang X., Yan H. Oligonucleotide Phosphoroselenoates egyszerű szintézise // Org. Lett. - 2007. - T. 9 , 24. sz . - S. 5103-5106 . - doi : 10.1021/ol702305v .
  11. ↑ Froehler BC Deoxinukleozid- H-foszfonát-diészter köztitermékek az internukleotid-foszfát-analógok szintézisében // Tetrahedron Lett. - 1986. - T. 27 , 46. sz . - S. 5575-5578 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)85269-7 .
  12. ↑ Froehler BC, Ng PG, Matteucci MD A DNS foszforamidát analógjai: heteroduplexek szintézise és hőstabilitása // Nucl. Acids Res. - 1988. - T. 16 , 11. sz . - S. 4831-4839 . doi : 10.1093 / nar/16.11.4831 .
  13. ↑ Kung PP, Jones RA H-foszfonát DNS szintézis aminovédelem nélkül // Tetrahedron Lett. - 1992. - T. 33 , 40. sz . - S. 5869-5872 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)61075-4 .
  14. ↑ Gilham PT, Khorana HG Studies on Polynucleotides. I. Új és általános módszer a C5″-C3″ internukleotid kötés kémiai szintézisére. Dezoxiribo-dinukleotidok szintézise  (angol)  // J. Am. Chem. szoc. - 1958. - 1. évf. 80 , sz. 23 . - P. 6212-6222 . - doi : 10.1021/ja01556a016 .
  15. ↑ Letsinger RL, Mahadevan V. Oligodezoxiribonukleotidok lépcsőzetes szintézise oldhatatlan polimer hordozón  //  J. Am. Chem. szoc. - 1966. - 1. évf. 88 , sz. 22 . - P. 5319-5324 . - doi : 10.1021/ja00974a053 . — PMID 10.1021/ja00974a053.
  16. ↑ Letsinger RL, Ogilvie KK Nukleotidkémia. XIII. Oligotimidilátok szintézise foszfotriészter köztitermékeken keresztül  (angol)  // J. Am. Chem. szoc. - 1969. - 1. évf. 91 , sz. 12 . - P. 3350-3355 . - doi : 10.1021/ja01040a042 .
  17. ↑ Reese CB Az oligo- és polinukleotidok kémiai szintézise foszfotriészter megközelítéssel   // Tetraéder . - 1978. - 1. évf. 34 , sz. 21 . - P. 3143-3179 . - doi : 10.1016/0040-4020(78)87013-6 .
  18. ↑ Efimov VA, Buryakova AA, Reverdatto SV, Chakhmakhcheva OG, Ovchinnikov Yu. A. Hosszú láncú dezoxiribooligonukleotidok gyors szintézise N-metilimidazolid foszfotriészter módszerrel   // Nucl . Acids Res. - 1983. - 1. évf. 11 , sz. 23 . - P. 8369-8387 . doi : 10.1093 / nar/11.23.8369 . Archiválva az eredetiből 2022. május 6-án.
  19. ↑ Efimov VA, Molchanova NS, Chakhmakhcheva OG Megközelítés természetes és módosított oligonukleotidok szintéziséhez foszfotriészter módszerrel O-nukleofil intramolekuláris katalízis segítségével  //  Nukleozidok, nukleotidok és nukleinsavak. - 2007. - Vol. 26 , sz. 8-9 . - P. 1087-1093 . - doi : 10.1080/15257770701516268 . — PMID 18058542 .
  20. ↑ Letsinger RL, Finnan JL, Heavner GA, Lunsford WB Nukleotidkémia. XX. Foszfitkapcsolási eljárás nukleotidok közötti kapcsolatok létrehozására  //  J. Am. Chem. szoc. - 1975. - 1. évf. 97 , sz. 11 . - P. 3278-3279 . - doi : 10.1021/ja00844a090 . — PMID 1133350 .
  21. ↑ Matteucci MD, Caruthers MH Dezoxioligonukleotidok szintézise polimer hordozón  //  J. Am. Chem. szoc. - 1981. - 1. évf. 103 , sz. 11 . - P. 3185-3191 . - doi : 10.1021/ja00401a041 .
  22. ↑ 1 2 3 Beaucage SL, Caruthers MH Deoxynucleoside phosphoramidites – A dezoxipolinukleotid szintézis kulcsfontosságú intermediereinek új osztálya  //  Tetrahedron Lett. - 1981. - 1. évf. 22 , sz. 20 . - P. 1859-1862 . - doi : 10.1016/S0040-4039(01)90461-7 .
  23. ↑ McBride LJ, Caruthers MH Nucleotide chemistry. X. Számos, dezoxi-oligonukleotidok szintézisére használható dezoxinukleozid-foszforamidit vizsgálata // Tetrahedron Lett. - 1983. - T. 24 , 3. sz . - S. 245-248 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)81376-3 .
  24. ↑ Adams SP, Kavka KS, Wykes EJ, Holder SB, Galluppi GR Gátolt dialkilamino-nukleozid-foszfit reagensek két DNS 51-mer szintézisében // J. Amer. Chem. szoc. - 1983. - T. 105 , 3. sz . - S. 661-663 . - doi : 10.1021/ja00341a078 .
  25. ↑ 1 2 Sinha ND, Biernat J., McManus J., Köster H. Polimer hordozó oligonukleotid szintézis XVIII1.2): β-cianoetil-N,N-dialkilamino-/N-morfolino-foszforamidit alkalmazása dezoxinukleozidok DNS szintéziséhez fragmensek, amelyek egyszerűsítik a védőcsoport eltávolítását és a végtermék izolálását   // Nucl . Acids Res. - 1984. - 1. évf. 12 , sz. 11 . - P. 4539-4557 . doi : 10.1093 / nar/12.11.4539 .
  26. ↑ 1 2 Beaucage SL, Iyer RP Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach   // Tetrahedron . - 1992. - 1. évf. 48 , sz. 12 . - P. 2223-2311 . - doi : 10.1016/S0040-4020(01)88752-4 .
  27. ↑ Glen Research. Alkalmazott Biosystems DNS- és RNS-szintetizáló  reagensek . Letöltve: 2012. december 2. Az eredetiből archiválva : 2013. január 16..
  28. ↑ Gryaznov SM, Letsinger RL Oligonukleotidok szintézise nem védett bázisú monomereken keresztül  //  J. Am. Chem. szoc. - 1991. - 1. évf. 113. sz . 15 . - P. 5876-5877 . doi : 10.1021 / ja00015a059 .
  29. ↑ Virta P. Bázisérzékeny oligonukleotidok szilárd fázisú szintézise   // ARKIVOC . - 2009. - P. 54-83 . - ISSN 1551-7012 . Az eredetiből archiválva : 2015. október 11.
  30. ↑ 1 2 3 Reddy MP, Hanna NB, Farooqui F. Ultragyors hasítás és oligonukleotidok védőcsoportjának eltávolítása C Ac származékok  szintézise és használata //  Nucleozids and Nucleotides. - 1997. - 1. évf. 16 , sz. 7-9 . - P. 1589-1598 . - doi : 10.1080/07328319708006236 .
  31. ↑ McMinn DL, Greenberg MM 3'-alkil-aminokat tartalmazó oligonukleotidok szintézise N-izobutiril-védett dezoxiadenozin-foszforamidit felhasználásával  //  Tetrahedron Lett. - 1997. - 1. évf. 38 , sz. 18 . - P. 3123-3126 . - doi : 10.1016/S0040-4039(97)00568-6 .
  32. ↑ Schulhof JC, Molko D., Teoule R. Az oligonukleotid szintézis utolsó védőcsoport-eltávolítási lépése enyhe és gyors ammóniás kezelésre redukálódik labilis bázisvédő csoportok alkalmazásával   // Nucl . Acids Res. - 1987. - 1. évf. 15 , sz. 2 . - P. 397-416 . doi : 10.1093 / nar/15.2.397 . — PMID 3822812 . Az eredetiből archiválva : 2022. március 14.
  33. ↑ Zhu Q., Delaney MO, Greenberg MM . Gyorsan védő foszforamiditekkel és ultra-enyhe védőcsoport-eltávolítással előállított oligonukleotidok N-acetilációjának megfigyelése és eliminálása   // Bioorg . Med. Chem. Lett. - 2001. - Vol. 11 , sz. 9 . - P. 1105-1107 . - doi : 10.1016/S0960-894X(01)00161-5 . — PMID 11354354 .
  34. ↑ McBride LJ, Kierzek R., Beaucage SL, Caruthers MH Nucleotide chemistry. 16. Amidin védőcsoportok oligonukleotid szintézishez  (angol)  // J. Am. Chem. szoc. - 1986. - 1. évf. 108 , sz. 8 . - P. 2040-2048 . doi : 10.1021 / ja00268a052 .
  35. ↑ Guzaev AP, Manoharan M. Phosphoramidite Coupling to Oligonucleotids Bearing Unprotected Internukleozid Phosphate Moities  //  J. Org. Chem. - 2001. - Vol. 66 , sz. 5 . - P. 1798-1804 . - doi : 10.1021/jo001591e . — PMID 11262130 .
  36. ↑ Ogilvie KK, Theriault N., Sadana KL Synthesis of oligoribonucleotides  //  J. Am. Chem. szoc. - 1977. - 1. évf. 99 , sz. 23 . - P. 7741-7743 . - doi : 10.1021/ja00465a073 .
  37. ↑ Usman N., Pon RT, Ogilvie KK Ribonukleozid 3'-O-foszforamiditek előállítása és alkalmazása oligonukleotidok automatizált szilárd fázisú szintézisében  //  Tetrahedron Lett. - 1985. - 1. évf. 26 , sz. 38 . - P. 4567-4570 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)98753-7 .
  38. ↑ Scaringe SA, Francklyn C., Usman N. Biológiailag aktív oligoribonukleotidok kémiai szintézise β-cianoetil védett ribonukleozid foszforamiditekkel   // Nucl . Acids Res. - 1990. - 1. évf. 18 , sz. 18 . - P. 5433-5441 . doi : 10.1093 / nar/18.18.5433 .
  39. ↑ Pitsch S., Weiss PA, Wu X., Ackermann D., Honegger T. RNS és részlegesen 2′-O-védett prekurzorok ('Caged RNA) gyors és megbízható automatizált szintézise, ​​két új, ortogonális 2′- alapján O-védő csoportok, előzetes kommunikáció   // Helv . Chem. acta. - 1999. - 1. évf. 82 , sz. 10 . - P. 1753-1761 . - doi : 10.1002/(SICI)1522-2675(19991006)82:10<1753::AID-HLCA1753>3.0.CO;2-Y .
  40. ↑ Pitsch S., Weiss PA, Jenny L., Stutz A., Wu X. Oligoribonukleotidok (RNS) megbízható kémiai szintézise 2′-O-[(triizopropil-szilil)oxi]metil(2'-O-tom)-védelemmel Foszforamiditek  (angol)  // Helv. Chem. acta. - 2001. - Vol. 84 , sz. 12 . - P. 3773-3795 . - doi : 10.1002/1522-2675(20011219)84:12<3773::AID-HLCA3773>3.0.CO;2-E .
  41. ↑ Guzaev A., Salo H., Azhayev A., Lönnberg H. Egy új megközelítés az 5'-terminális oligonukleotidok kémiai foszforilációjához   // Tetrahedron . - 1995. - 1. évf. 51 , sz. 34 . - P. 9375-9384 . - doi : 10.1016/0040-4020(95)00544-I .
  42. ↑ Sinha ND, Cook RM Funkcionalizált szintetikus oligonukleotidok előállítása és alkalmazása: III. Védett amino-hexanol és merkapto-propanol vagy -hexanol H-foszfonát származékainak alkalmazása  //  Nucl. Acids Res. - 1988. - 1. évf. 16 , sz. 6 . - P. 2659-2670 . doi : 10.1093 / nar/16.6.2659 . Archiválva az eredetiből 2022. május 6-án.
  43. ↑ Ede NJ, Tregear GW, Haralambidis J. Tiol-oligonukleotidok rutin előállítása: Alkalmazás az oligonukleotid-peptid hibridek szintézisére  //  Bioconjugate Chem. - 1994. - 1. évf. 5 , sz. 4 . - 373-378 . o . doi : 10.1021 / bc00028a016 . — PMID 7948105 .
  44. ↑ Podyminogin MA, Lukhtanov EA, Reed MW Benzaldehiddel módosított oligodezoxinukleotid próbák csatlakoztatása szemikarbaziddal bevont üveghez   // Nucl . Acids Res. - 2001. - Vol. 29 , sz. 24 . - P. 5090-5098 . doi : 10.1093 / nar/29.24.5090 .
  45. ↑ Lebedev AV, Combs D., Hogrefe RI előaktivált karboxil linker alkilaminok gyors konjugációjához oligonukleotidokhoz szilárd  hordozón //  Bioconjugate Chem. - 2007. - Vol. 18 , sz. 5 . - P. 1530-1536 . doi : 10.1021 / bc0603891 . — PMID 17877414 .
  46. ↑ Alvira M., Eritja R. 5'-5' kapcsolatokat hordozó oligonukleotidok szintézise rézkatalizált cikloaddíciós reakciók segítségével   // Chem . biológiai sokféleség. - 2007. - Vol. 4 , sz. 12 . - P. 2798-2809 . - doi : 10.1002/cbdv.200790229 . — PMID 18081090 .
  47. ↑ Kvach MV, Tsybulsky DA, Ustinov AV, Stepanova IA, Bondarev SL, Gontarev SV, Korshun VA, Shmanai VV 5(6 ) -Carboxyfluorescein Revisited: New Protecting Group, Separation of Isomers, and their Spectral Properties on   Chem/Oligonm/Checkonjuotides . - 2007. - Vol. 18 , sz. 5 . - P. 1691-1696 . - doi : 10.1021/bc7001874 . — PMID 17696491 .
  48. ↑ Jäschke A., Fürste JP, Nordhoff E., Hillenkamp F., Cech D., Erdmann VA Oligodezoxiribonukleotid-polietilénglikol konjugátumok szintézise és tulajdonságai   // Nucl . Acids Res. - 1994. - 1. évf. 22 , sz. 22 . - P. 4810-4817 . doi : 10.1093 / nar/22.22.4810 . — PMID 7984434 .
  49. ↑ Musumeci D., Montesarchio D. A koleszteril-HEG foszforamidit származék szintézise és alkalmazása az anti-HIV 5'TGGGAG3' Hotoda-szekvencia lipidkonjugátumaira   // Molecules . - 2012. - Kt. 17 . - P. 12378-12392 . - doi : 10,3390/molecules171012378 . — PMID 23090019 . Archiválva az eredetiből 2015. november 2-án.
  50. ↑ Kayushin A., Demekhina A., Korosteleva M., Miroshnikov A., Azhayev A. Synthesis of biotin-containing phosphoramidite linker with polyether spacer arm  //  Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. - 2011. - 20. évf. 30 , sz. 7-8 . - P. 490-502 . doi : 10.1080 / 15257770.2011.587702 . — PMID 21888541 .
  51. ↑ Sproat B., Colonna F., Mullah B., Tsou D., Andrus A., Hampel A., Vinayak R. An Efficient Method for the Isolation and Purification of Oligoribonucleotides  //  Nucleosides and Nucleotides. - 1995. - 1. évf. 14 , sz. 1-2 . - P. 255-273 . - doi : 10.1080/15257779508014668 .
  52. ↑ Welz R., Müller S. 5-(Benzylmercapto)-1H-tetrazol as activator for 2'-O-TBDMS phosphoramidite building blocks in RNA synthesis  //  Tetrahedron Lett. - 2002. - 20. évf. 43 , sz. 5 . - 795-797 . o . - doi : 10.1016/S0040-4039(01)02274-2 .
  53. ↑ Vargeese C., Carter J., Yegge J., Krivjansky S., Settle A., Kropp E., Peterson K., Pieken W. Efficient activation of nucleoside phosphoramidites with 4,5-dicyanoimidazole during oligonucleotide synthesis   // Nucl. Acids Res. - 1998. - 1. évf. 26 , sz. 4 . - P. 1046-1050 . - doi : 10.1093/nar/26.4.1046 . Archiválva az eredetiből 2022. május 6-án.
  54. ↑ Usman N., Ogilvie KK, Jiang MY, Cedergren RJ Hosszú oligoribuncleotidok automatizált kémiai szintézise 2'-O-szililezett ribonukleozid 3'-O-foszforamiditekkel szabályozott pórusú üveghordozón: hasonló 43 nukleotid szekvencia szintézise egy Escherichia coli formilmetionin tRNS 3'-fél molekulájához // J. Amer. Chem. szoc. - 1987. - T. 109 , 25. sz . - S. 7845-7854 . doi : 10.1021 / ja00259a037 .
  55. ↑ Ogilvie KK, Usman N., Nicoghosian K., Cedergren RJ Egy 77 nukleotid hosszúságú RNS-szekvencia teljes kémiai szintézise, ​​amelynek metionin-elfogadó aktivitása van  // Proc. Natl. Acad. sci. USA. - 1988. - T. 85 , 16. sz . - S. 5764-5768 . - doi : 10.1073/pnas.85.16.5764 . — PMID 3413059 .
  56. ↑ Wu T., Ogilvie KK, Perreault JP, Cedergren RJ. Kényelmes eljárás specifikus kevert DNS-RNS polimerek előállítására // J. Amer. Chem. szoc. - 1989. - T. 111 , 22. sz . - S. 8531-8533 . - doi : 10.1021/ja00204a043 .
  57. ↑ Pon RT Fokozott kapcsolási hatékonyság 4-dimetilaminopiridin (DMAP) és tetrazol, 5-(o-nitrofenil)tetrazol vagy 5-(p-nitrofenil)tetrazol alkalmazásával az oligoribonukleotidok szilárd fázisú szintézisében a foszforamidit eljárással // Tetrahedron Lett . - 1987. - T. 28 , 32. sz . - S. 3643-3646 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)96344-5 .
  58. ↑ Pon RT, Usman N., Damha MJ, Ogilvie KK . A guanin módosításának és lánchasadásának megelőzése oligonukleotidok szilárd fázisú szintézise során foszforamidit származékok felhasználásával   // Nucl . Acids Res. - 1986. - 1. évf. 14 , sz. 16 . - P. 6453-6470 . doi : 10.1093 / nar/14.16.6453 . — PMID 3748816 . Archiválva az eredetiből 2022. május 6-án.
  59. ↑ Alul RH, Singman CN, Zhang G., Letsinger RL Oxalyl-CPG: labilis hordozó érzékeny oligonukleotid származékok szintéziséhez  // Nucl. Acids Res. - 1991. - T. 19 , 7. sz . - S. 1527-1532 . - doi : 10.1093/nar/19.7.1527 . — PMID 2027761 . Archiválva az eredetiből 2022. május 6-án.
  60. ↑ Új termék : 0,5 M CSO nemvizes oxidációhoz a DNS-szintézisben  . glenres.com. Hozzáférés dátuma: 2013. január 28. Az eredetiből archiválva : 2013. február 4.
  61. ↑ Bioautomatizálás. DNS/RNS oligonukleotid szintetizátor: MerMade 384 (nem elérhető link) . Letöltve: 2012. december 3. Az eredetiből archiválva : 2011. szeptember 30.. 
  62. ↑ 1 2 3 Guzaev AP, Pon RT Nukleozidok és egyéb linkerek kapcsolódása szilárd fázisú hordozókhoz az oligonukleotid szintézishez // Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry . Wiley, 2013.
  63. ↑ 1 2 3 Pon RT szilárd fázisú hordozók oligonukleotid szintézishez // Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. – Wiley, 2001.
  64. ↑ 1 2 Vaijayanthi B., Kumar P., Ghosh PK, Gupta KC Az oligonukleotid szintézis legújabb eredményei és alkalmazásaik  //  Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. - 2003. - 1. évf. 40 , sz. 6 . - P. 377-391 . — PMID 22900365 . Archiválva az eredetiből 2017. augusztus 14-én.
  65. ↑ Guzaev AP, Manoharan M. A konformációsan előre szervezett univerzális szilárd támogatás a hatékony oligonukleotid szintézishez  //  J. Am. Chem. szoc. - 2003. - 1. évf. 125 , sz. 9 . - P. 2380-2381 . - doi : 10.1021/ja0284613 . — PMID 12603111 .
  66. ↑ Petrie CR, Reed MW, Adams AD, Meyer Jr. RB Továbbfejlesztett CPG-támogatás 3'-amin-farkú oligonukleotidok szintéziséhez  //  Bioconjugate Chem. - 1992. - 1. évf. 3 , sz. 1 . - 85-87 . o . - doi : 10.1021/bc00013a014 . — PMID 1616954 .
  67. ↑ Linktechnológiák. 3'-Thiol Modifier C3 SS CPG (nem elérhető link) . Hozzáférés dátuma: 2012. december 4. Eredetiből archiválva : 2013. június 29. 
  68. ↑ Lumiprobe. Black Hole 1 (BHQ-1) kioltó CPG (nem elérhető link) . Hozzáférés dátuma: 2012. december 4. Az eredetiből archiválva : 2010. november 23. 
  69. ↑ Wilk A., Grajkowski A., Phillips LR, Beaucage SL Deoxyribonucleoside Cyclic N-Acylphosphoramidites as a New Class of Monomer for the Stereocontrolled Synthesis of Oligothymidyl- and Oligodeoxycytidyl-Phosphorothioates //Jojotiomerek. Chem. szoc. - 2000. - T. 122 , 10. sz . - S. 2149-2156 . doi : 10.1021 / ja991773u .
  70. ↑ Lebedev AV, Wickstrom E. The chirality problem in P-substituted oligonucleotides  //  Perspectives in Drug Discovery and Design. - 1996. - 1. évf. 4 , sz. 1 . - P. 17-40 . - doi : 10.1007/BF02172106 .
  71. ↑ 1 2 Guzaev AP 3H-1,2,4-ditiazol-3-tionok és 3H-1,2-ditiol-3-tionok reaktivitása oligonukleotid-szintézis kénezőszerként  (angol)  // Tetrahedron Lett. - 2011. - 20. évf. 52 , sz. 3 . - P. 434-437 . - doi : 10.1016/j.tetlet.2010.11.086 .
  72. ↑ Iyer RP, Egan W., Regan JB, Beaucage SL 3H-1,2-Benzodithiole-3-on 1,1-dioxide as an wellfurizing reagens in the solid-phase synthesis of oligodeoxyribonucleosid phosphorothioates  //  J .Am. Chem. szoc. - 1990. - 1. évf. 112 , sz. 3 . - P. 1253-1254 . - doi : 10.1021/ja00159a059 .
  73. ↑ Vu H., Hirschbein BL Nukleotidok közötti foszfit kénezés tetraetiltiuram-diszulfiddal. Foszforotioát oligonukleotid szintézis foszforamidit kémiával  (angol)  // Tetrahedron Lett. - 1991. - 1. évf. 32 , sz. 26 . - P. 3005-3008 . - doi : 10.1016/0040-4039(91)80672-S .
  74. ↑ Efimov VA, Kalinkina AL, Chakhmakhcheva OG, Hill TS, Jayaraman K. Új, hatékony szulfurizáló reagensek oligodezoxiribonukleotid foszforotioát analógok előállításához (ut) // Nucl. Acids Res. - 1995. - T. 23 , 20. sz . - S. 4029-4033 . doi : 10.1093 / nar/23.20.4029 . — PMID 7479060 .
  75. ↑ Ito H., Ike Y., Ikuta S., Itakura K. Solid phase synthesis of polynucleotides. VI. További vizsgálatok a szilárd hordozó polisztirol kopolimerjeiről   // Nucl . Acids Res. - 1982. - 1. évf. 10 , sz. 5 . - P. 1755-1769 . doi : 10.1093 / nar/10.5.1755 .
  76. ↑ Tanaka T., Letsinger RL Syringe módszer oligonukleotidok lépcsőzetes kémiai szintézisére   // Nucl . Acids Res. - 1982. - 1. évf. 10 , sz. 10 . - P. 3249-3259 . doi : 10.1093 / nar/10.10.3249 . — PMID 7099961 . Archiválva az eredetiből 2022. május 6-án.
  77. ↑ Alvarado-Urbina G., Sathe GM, Liu WC, Gillen MF, Duck PD, Bender R., Ogilvie KK Automated synthesis of gene fragments   // Science . - 1981. - 1. évf. 214. sz . 4518 . - 270-274 . - doi : 10.1126/tudomány.6169150 .
  78. ↑ Bioautomatizálás. DNS/RNS oligonukleotid szintetizátor: MerMade . Hozzáférés időpontja: 2012. december 11. Az eredetiből archiválva : 2013. január 16.
  79. ↑ BIOSSET (elérhetetlen hivatkozás) . Letöltve: 2012. december 11. Az eredetiből archiválva : 2012. november 3.. 
  80. ↑ Azco Biotech Inc. Azco DNS/RNS szintetizátorok (nem elérhető link) . Letöltve: 2012. december 11. Az eredetiből archiválva : 2011. szeptember 15.. 
  81. ↑ Boal JH, Wilk A., Harindranath N., Max EE, Kempe T., Beaucage SL Oligodezoxiribonukleotidok hasítása szabályozott pórusú üveghordozókból és gyors védőcsoport-eltávolításuk gáznemű aminokkal   // Nucl . Acids Res. - 1996. - 1. évf. 24 , sz. 15 . - P. 3115-3117 . doi : 10.1093 / nar/24.15.3115 . Az eredetiből archiválva: 2016. január 20.
  82. ↑ Westman E., Strömberg R. A t-butil-dimetil-szilil védelem eltávolítása az RNS szintézisben.  A trietil-amin-trihidrofluorid (TEA, 3HF) a tetrabutil-ammónium-fluorid (TBAF ) megbízhatóbb alternatívája  // Nucl. Acids Res. - 1994. - 1. évf. 22 , sz. 12 . - P. 2430-2431 . - doi : 10.1093/nar/22.12.2430 . — PMID 7518583 .
  83. ↑ Capaldi DC, Gaus H., Krotz AH, Arnold J., Carty RL, Moore MN, Scozzari AN, Lowery K., Cole DL, Ravikumar VT Synthesis of High-Quality antisense Drugs. Akrilnitril hozzáadása foszforotioát oligonukleotidokhoz: Adduktok jellemzése és elkerülése   // Org . Proc. Res. dev. - 2003. - 1. évf. 7 , sz. 6 . - P. 832-838 . - doi : 10.1021/op020090n .
  84. ↑ Glen Research. Védőcsoport eltávolítása - 5. kötet - Oligonukleotidok védőcsoportjainak eltávolítása szerves oldószerekben . Hozzáférés időpontja: 2012. december 11. Az eredetiből archiválva : 2013. január 16.
  85. ↑ Alkalmazott biorendszerek. Szintetikus oligonukleotidok értékelése és izolálása. A teljes útmutató (2002). Letöltve: 2013. április 15. Az eredetiből archiválva : 2013. április 19..
  86. ↑ A szintetikus oligonukleotidok értékelése és izolálása, 2002 , pp. 2-5-2-6.
  87. ↑ A szintetikus oligonukleotidok értékelése és izolálása, 2002 , pp. 3-1-3-19.
  88. ↑ A szintetikus oligonukleotidok értékelése és izolálása, 2002 , pp. 4-1-4-15.
  89. ↑ Krotz AH, Gaus H., Hardee GE Oligonukleotid adduktok képződése gyógyszerkészítményekben // Gyógyszerfejlesztés és technológia. - 2005. - T. 10 , 2. sz . - S. 283-90 . - doi : 10.1081/PDT-54464 . — PMID 15926677 .
  90. ↑ Willems A., Deforce DL, Van Bocxlaer J. Oligonukleotidok elemzése kapilláris zóna elektroforézissel és elektropermet tömegspektrometriával // Methods in Molecular Biology. - Springer, 2008. - T. 384. Kapilláris elektroforézis. - S. 401-414. — ISBN 978-1-59745-376-9 . - doi : 10.1007/978-1-59745-376-9_14 .

Irodalom

Főbb eredeti művek

  • Caruthers MH DNS és DNS-analógok kémiai szintézise   // Acc . Chem. Res. - 1991. - 1. évf. 24 , sz. 9 . - P. 278-284 . doi : 10.1021 / ar00009a005 .
  • Letsinger RL, Mahadevan V. Oligodezoxiribonukleotidok lépcsőzetes szintézise oldhatatlan polimer hordozón  //  J. Am. Chem. szoc. - 1966. - 1. évf. 88 , sz. 22 . - P. 5319-5324 . - doi : 10.1021/ja00974a053 . — PMID 10.1021/ja00974a053.

Vélemények

  • Burtscher H., Berner S., Seibl R., Mühlegger K. Nukleinsavak // Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. - Wiley, 2000. - doi : 10.1002/14356007.a18_001 .
  • Iyer RP, Beaucage SL 7.05 Oligonukleotid szintézis // Comprehensive Natural Products Chemistry . - Elsevier, 1999. - P. 105-152.
  • Reese CB Oligo- és polinukleotidok: 50 éves kémiai szintézis   // Org . Biomol. Chem. - 2005. - 20. évf. 3 , sz. 21 . - P. 3851-3868 . doi : 10.1039 / b510458k . — PMID 16312051 .

Módszerek

Linkek