A Secretomics a proteomika egy része , amely egy sejt , szövet vagy szervezet összes szekretált fehérjét tanulmányozza [1] . A szekretált fehérjék nemcsak számos fiziológiai folyamatban vesznek részt, beleértve a celluláris jelátvitelt és az extracelluláris mátrix átalakulását, hanem a rosszindulatú sejtek inváziójának és metasztázisának is szerves részét képezik [2] . A szekréció tehát fontos a rák biomarkereinek azonosításában .
2000-ben Tjalsma és munkatársai alkották meg a secreto kifejezést a Bacillus subtilis baktériummal kapcsolatos munkájukban . A szekréciót úgy határozták meg, mint az összes szekretált fehérje összességét és egy baktérium szekréciós apparátusát. A B. subtilis fehérjeszekvenciáit tartalmazó adatbázis és a szekretált fehérjékre és N-terminális szignálpeptidekre jellemző hidrolízis helyeket ellenőrző algoritmus segítségével meg tudták jósolni, hogy a sejt mekkora részét választja ki a proteomból [3] . 2001-ben ugyanez a laboratórium állította fel a szekretomika mércéjét: az egyetlen aminosav- szekvencián alapuló előrejelzések nem elegendőek a szekréció meghatározásához. 2D elektroforézissel és tömegspektrometriával 82 B. subtilis által szekretált fehérjét azonosítottak , amelyek közül csak 48-at jósoltak meg aminosavszekvencia alapján a korábbi munkájukban leírt módszerrel [4] .
Annak megértése, hogy sok nem hagyományos szekréciós út létezik, és hogy sok nem szekretált fehérje a hagyományos szekréciós útvonal része, szükségessé tette a szekréció mélyebb meghatározását. 2010-ben Agrawal és munkatársai azt javasolták, hogy a titkot úgy definiálják, mint "egy sejt, szövet, szerv vagy szervezet által az extracelluláris térbe szekretált fehérjék globális csoportja egy tetszőleges időpontban és tetszőleges körülmények között ismert és ismeretlen szekréciós mechanizmusok révén, beleértve a szabályozatlan és szabályozott szekréciós organellumokat » [5] .
Eredeti szöveg (angol)[ showelrejt] Javasoljuk a szekréció átdolgozott definícióját: „egy sejt, szövet, szerv vagy szervezet által bármely adott időpontban és körülmények között az ECS-be szekretált fehérjék globális csoportja ismert és ismeretlen szekréciós mechanizmusokon keresztül, beleértve a konstitutív és szabályozott szekréciós organellumokat”.A szennyeződések mindig jelen vannak a sejttenyészetben . A tenyésztő tápközegből származó szarvasmarha-szérum és a sejttörmelék szennyezi az elemzéshez használt szekretált fehérjéket. A szarvasmarha-szérum szennyező komponensei különösen aggodalomra adnak okot, mivel sokuk fehérjeszekvenciája hasonló az emberihez (pl. fibronektin és fibulin-1 ) [1] . A szennyeződések eltávolítása érdekében a sejteket nátrium-foszfát pufferrel (PBS) vagy szérummentes tápközeggel (SFM) kell mosni az SFM-ben történő inkubálás és a szekretált fehérjék összegyűjtése előtt. Az intracelluláris fehérjék felszabadulását célzó minden manipulációt óvatosan kell végrehajtani, hogy elkerüljük a sejtkárosodást [1] . Ezen túlmenően az inkubáció ideje és körülményei optimalizálhatók, hogy a táptalaj hiánya által okozott metabolikus stressz ne befolyásolja a szekretomaanalízist [6] .
Egyes fehérjéket alacsony koncentrációban állítanak elő, majd táptalajban vagy testnedvekben hígítanak. Az ilyen fehérjéket nehéz kimutatni. A kis mennyiségek kimutatására szolgáló technikák, mint például a fehérjék triklór-ecetsavval történő kicsapása , olyan rendkívül érzékeny módszerekkel együtt használhatók, mint például az antitest microarray alkalmazása , amely akár egyetlen fehérjemolekulát is képes kimutatni [ 7] .
Számos szekréciós vizsgálatot végeznek in vitro sejttenyésztési technikák alkalmazásával. De továbbra sem világos, hogy ugyanazok a fehérjék in vivo körülmények között is kiválasztódnak-e . Egyre több tanulmány, különösen a tumorszekréciót elemző tanulmányok alkalmaznak in vivo módszereket a laboratóriumban kapott eredmények konzisztenciájának megerősítésére. Például a daganat közelében lévő proximális testfolyadékokat szekrécióelemzés céljából összegyűjtik [1] .
Sok szekretált fehérje rendelkezik egy N-terminális peptidszekvenciával , amely felelős a transzlált fehérje endoplazmatikus retikulumba (ER) történő transzlokációjáért . Az ER-ben fehérjefeldolgozás megy végbe , ami végül szekrécióhoz vezet. Ezeknek a szignálpeptideknek a jelenléte felhasználható a sejt szekréciójának előrejelzésére. Az olyan programok, mint a SignalP , képesek azonosítani a szignálszekvenciákat (és azok hidrolízis helyeit), hogy előre jelezzék a szekretált fehérjéket. Mivel a transzmembrán fehérjéket is feldolgozzák az ER-ben, de nem szekretálódnak, a TMHMM szerverhez hasonló programokat használnak a transzmembrán domének előrejelzésére , és így kiküszöbölik a hamis pozitívakat . Néhány szekretált fehérje nem rendelkezik klasszikus szignálpeptid szekvenciákkal. Ezeket a fehérjéket, amelyekből hiányzik az N-terminális szekréciós vezető, hiányozni fog a SignalP. A SecretomeP egy olyan program, amelyet kifejezetten arra terveztek, hogy megpróbálja megjósolni a nem klasszikus szekréciós fehérjéket szekvenciáikból [5] . A genomra kiterjedő szekretómákat jósoltak számos organizmus számára, beleértve az embereket , egereket , zebrahalakat és több száz baktériumot [5] .
A teljes genom-előrejelzési módszereknek számos problémája van. Nagy a valószínűsége a hamis pozitív és hamis negatív eredményeknek. Ezenkívül a génexpresszió nagymértékben függ a környezeti feltételektől, ami azt jelenti, hogy a genomiális vagy cDNS-könyvtárakból megjósolt szekréció valószínűleg nem esik teljesen egybe a valódi szekrécióval. Az így kapott adatok megerősítéséhez proteomikai megközelítésekre van szükség [5] .
Számos genomszintű szekréció és tudásbázis áll rendelkezésre a gondozás és a számítógépes előrejelzések alapján. Ezek az adatbázisok a következőket foglalják magukban: a Fungal Secretome Database (FSD), a Fungal Secretome Knowledge Base (FunSecKB), a Fungal Secretome és Intracellular Proteome Knowledge Base (FunSecKB2), a Plant Secretome és Intracellular Proteome Knowledge Base (PlantSecKB) és a Tejsavbaktérium Secretome adatbázis . A közelmúltban megjelent a Metazoa Secretome és Intracellular Proteome Database (MetazSecKB) és a Protist Secretome és Intracellular Proteome Database (ProtSecKB) . Bár a számítógépes előrejelzésekben van néhány pontatlanság, ezek az adatbázisok hasznos forrásokat biztosítanak a fehérjék sejten belüli elhelyezkedésének további jellemzéséhez.
A tömegspektrometriás elemzés a szekretomika szerves részét képezi. A szekretált fehérjéket tartalmazó szérumot vagy felülúszót proteáz emészti fel , és a fehérjéket kétdimenziós gélelektroforézissel vagy kromatográfiás technikákkal választják el . Ezután minden egyes fehérjét tömegspektrometriával elemzünk, és a kapott peptid tömegspektrumot egy adatbázisban tekinthetjük meg a fehérje azonosítása érdekében [1] .
Az aminosav-alapú, nem radioaktív izotópos jelölési (SILAC) módszer alkalmazása sejttenyészetben segíthet megkülönböztetni a szekretált fehérjét és a szarvasmarha szérumból származó szennyeződéseket a sejttenyészetben. A normál tápközegben tenyésztett sejtek felülúszóját és az aminosavakkal jelölt tápközegből származó sejteket 1:1 arányban összekeverik, majd tömegspektrometriával elemzik . A szérumban lévő fehérjeszennyeződések csak egy csúcsot mutatnak, mivel nincs jelölt ekvivalensük [1] . Példa erre a SILAC sikeres alkalmazása a humán kondrociták által kiválasztott fehérjék és a szérum szennyeződései közötti különbségtételre [8] .
Az utóbbi időben a szekretomaanalízis részévé vált az antitest microarray alkalmazása, amely egy rendkívül érzékeny és nagy áteresztőképességű fehérje kimutatási módszer. Az antitestek vagy más kötőmolekulák szilárd hordozóhoz vannak rögzítve. Ezt követően fluoreszcensen jelölt fehérje keverékét adjuk hozzá. A jel intenzitását a fehérjék azonosítására használják. Az antitest microarray-ek rendkívül sokoldalúak: felhasználhatók a keverékben lévő fehérje mennyiségének elemzésére, más fehérje izoformák , poszttranszlációs módosulások elemzésére, valamint a fehérjék biokémiai aktivitásának elemzésére. Ezen túlmenően ezek a mikrotömbök nagyon érzékenyek: képesek egyetlen fehérjemolekulát kimutatni. Az antitest microarray-eket jelenleg inkább humán plazmaminták elemzésére használják, de felhasználhatók tenyésztett sejtek és biológiai folyadékok szekréciós elemzésére is , egyszerű módot biztosítva több fehérje egyidejű kimutatására [7] .
A szekretált fehérjék a normál élettani folyamatokban betöltött fontos szerepük mellett a karcinogenezisben is fontos szerepet játszanak , részt vesznek a sejtnövekedésben, a migrációban és az invázióban, valamint az angiogenezisben . Ezek a szempontok a szekréciót kiváló módszerré teszik a rák biomarkereinek kimutatására [9] . A proteomikus módszer alkalmazását a rák biomarkereinek kimutatására biológiai folyadékokban vagy szérumban nagymértékben megnehezítheti, hogy a testnedvek nagyon összetettek és heterogének. A rákos sejtvonalak szekréciós elemzése a beteg szövetekben egyszerűbb és pontosabb alternatívát jelent a biomarkerek kimutatására [6] .
A rák szekréciós elemzéséhez két fő anyagtípust használnak: rákos sejtvonalak felülúszóit és biológiai folyadékokat (proximális és a daganattal érintkező folyadékok ). A rákos sejtvonalak felülúszója a szekretált fehérjék előnyben részesített forrása. Számos tenyésztett vonal áll rendelkezésre, és könnyebb a felülúszót elemezni, mint a proximális testfolyadékot. De továbbra sem világos, hogy a sejtvonal titka jól reprezentálja-e a valódi daganatot a sajátos mikrokörnyezetében. Ráadásul a tenyésztett sejtvonalak nem mutatják a valódi daganat heterogenitását [9] . A proximális folyadékanalízis jobb megértést biztosíthat egy személy tumorszekréciójáról, de ennek a módszernek is megvannak a maga hátrányai. A proximális folyadékgyűjtési eljárásokat szabványosítani kell, és jóindulatú kontrollokra van szükség. Ezenkívül a betegek közötti szerzett és genetikai különbségek megnehezíthetik az elemzést [9] .
A Secretome elemzés új potenciális biomarkereket tárt fel számos ráktípusra, beleértve a tüdőrákot , a májrákot , a hasnyálmirigyrákot , a vastag- és végbélrákot , a prosztatarákot és a mellrákot . A prosztata specifikus antigén (PSA) , a prosztatarák jelenlegi standard biomarkere alacsony diagnosztikai specificitással rendelkezik: a PSA szintje nem mindig különböztethető meg a rosszindulatú és jóindulatú daganatok között, ezért specifikusabb biomarkerre van szükség. A prosztata sejtvonalak szekréciós analízisének alkalmazása egy tanulmányban kimutatta, hogy több fehérje nagyobb mennyiségben van jelen a rákos betegek szérumában, mint az egészséges emberekben [6] .
Az emlőrák kimutatásához is nagy szükség van biomarkerekre: jelenleg csak az ilyen típusú daganatok előrehaladott stádiumainak monitorozására léteznek biomarkerek [2] . Az emlőrák sejtvonalak szekréciós elemzése a leukocita sejtadhéziót aktiváló fehérje (ALCAM) felfedezéséhez vezetett , amely egy új biomarker, amely ígéretes diagnosztikai potenciállal rendelkezik [6] .
Az emberi embrionális szekréciók elemzése hasznos lehet az embriók életképességének meghatározására szolgáló nem invazív módszerek keresésében . Az IVF morfológiai kritériumok szerint értékeli a nagy beágyazódási potenciállal rendelkező embriókat . A kvantitatív értékelési módszerrel végzett keresés segíthet csökkenteni az IVF során felhasznált embriók számát, ezáltal csökkentve a többes terhesség valószínűségét . Például egy tanulmányban szerezzen titkos ujjlenyomatokat sok blasztocisztáról , és találjon 9 fehérjét, amelyek eltérhetnek a normál és abnormális kromoszómaszámú blasztociszták között . Ez a módszer felváltja a preimplantációs genetikai diagnózist (PGD) , amely magában foglalja az embrionális sejtek biopsziáját, és káros lehet a magzat fejlődésére [10] .