adeno-asszociált vírus | ||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ||||||||
tudományos osztályozás | ||||||||
Csoport:Vírusok [1]Birodalom:MonodnaviriaKirályság:ShotokuviraeTípusú:cossaviricotaOsztály:QuintoviricetesRendelés:PiccoviralesCsalád:ParvovírusokAlcsalád:ParvovirinaeNemzetség:DependoparvovírusKilátás:adeno-asszociált vírus | ||||||||
Nemzetközi tudományos név | ||||||||
Adeno-asszociált dependoparvovírus A | ||||||||
Szinonimák | ||||||||
A Baltimore Csoport | ||||||||
II: ssDNS vírusok | ||||||||
|
Adeno-asszociált vírus ( eng. Adeno-asszociált dependoparvovirus A , AAV) egy kis vírus , amely megfertőzi az emberek és néhány más főemlős sejtjeit . Úgy tűnik, hogy az adeno-asszociált vírus nem okoz betegséget emberben, ezért gyenge immunválaszt vált ki.
Az adeno-asszociált vírus megfertőzheti az osztódó és nem osztódó sejteket, és integrálhatja genomját a gazda genomjába. Ezek a tulajdonságok az AAV-t különösen vonzó jelöltté teszik a génterápiás vírusvektorok tervezésében [ 4 ] .
Az adeno-asszociált vírus a parvovírusok családjába ( Parvoviridae ) tartozó Dependoparvovirus nemzetségbe tartozik . A vírus kicsi (20 nm), nem rendelkezik lipidburokkal, és nem kódolja saját replikációs enzimeit .
1965-ben Robert Atchison publikált egy új vírust, az adeno-asszociált vírust [5] . Vírusrészecskéket elektronmikroszkóppal detektáltak majom adenovírus készítményekben , amelyeket többször ültettek át primer rhesus majomvese sejtkultúrákra . Az Atchison-csoport ultraszűréssel választotta el az új vírus 24 nm-es részecskéit a nagyobb, 80 nm-es adenovírus részecskéktől [6] .
Az izolálást követően kimutatták, hogy a részlegesen tisztított adeno-asszociált vírusvirionok nem képesek önmagukban szaporodni , de képesek replikálódni és terjedni adenovírussal fertőzött tenyészetekben . Így az adeno-asszociált vírusról kiderült, hogy egy hibás kísérővírus, amelynek kiegészítő vírusra van szüksége a teljes replikációhoz. Mivel az adeno-asszociált vírus nem kódolja saját DNS-polimerázát , replikációjához egy helper vírusra, általában egy adenovírusra van szükség [7] .
2013 júliusában a család revíziója eredményeként 4 közeli rokon fajt egyesítettek egybe, a nemzetség nevét Dependoparvovirus -ra , a faj nevét Adeno-asszociált dependoparvovírus A-ra változtatták [3] .
A vad típusú adeno-asszociált vírusnak van néhány előnye a génterápia szempontjából . Az egyik fő előnye, hogy ez a vírus nem patogén . Az adeno-asszociált vírus megfertőzheti a nem osztódó sejteket, és a tizenkilencedik kromoszómán lévő specifikus helyeken (AAVS1) beépülhet a gazda genomjába [8] .
Ez a tulajdonság az adeno-asszociált vírust kiszámíthatóbbá teszi, mint a retrovírusokat . A retrovírusok potenciálisan veszélyesek mutagénként , mivel véletlenszerűen beépülnek a gazdaszervezet genomjába, ami rákos daganatok kialakulásához vezethet. Az adeno-asszociált vírusgenom általában egy meghatározott helyre inszertálódik, és véletlenszerű inszerciók elhanyagolható gyakorisággal fordulnak elő. Amikor adeno-asszociált víruson alapuló génterápiás vektorokat hoznak létre, a rep és cap géneket eltávolítják a vírus DNS-éből . A kívánt gén a promoterrel együtt invertált terminális ismétlődések ( inverted terminális ismétlődések, ITR) közé inszertálódik , aminek eredményeként a sejtmagban konkatamerek képződnek, miután a sejtes DNS polimeráz a második DNS- szálat szintetizálja . Az adeno-asszociált vírusokon alapuló génterápiás vektorok episzómális konkatamereket képeznek a gazdasejt magjában. A nem osztódó sejtekben ezek a konkatamerek érintetlenek maradnak; osztódó sejtekben az adeno-asszociált vírus DNS elveszik a sejtosztódás során, mivel az episzómális DNS nem replikálódik a gazdasejt DNS-replikációja során. Az adeno-asszociált vírus DNS-ének véletlen beépülése a gazda genomjába nagyon ritka. Az adeno-asszociált vírus immunogenitása is nagyon alacsony , amit nyilvánvalóan korlátoz a semlegesítő antitestek termelésének alacsony hatékonysága , míg az utóbbiról nem bizonyították egyértelműen, hogy citotoxikus [9] [10] [11] . A leírt jellemzők, valamint a nem osztódó sejtek fertőzésének képessége meghatározzák az adeno-asszociált vírus előnyeit az adenovírusokkal szemben a génterápiában.
Az adeno-asszociált vírus alkalmazásának vannak hátrányai is. A terápiás gének klónozására rendelkezésre álló vírusgenom kapacitása mindössze körülbelül 4800 bázispár . Így ez a vektor nem alkalmas nagy gének klónozására. A két genom fordított terminális ismétlődései hibridizálhatnak , és fej-farok konkatamereket képezhetnek, közel megkétszerezve a vektor kapacitását.
A vad típusú vírussal való fertőzés gyakran a humorális immunitás aktiválódását okozza . A semlegesítő antitestek aktivitása bizonyos esetekben csökkenti az AAV2 szerotípus alkalmazhatóságát. Az AAV2 az agyba is bejuthat , és erősen neuronspecifikus .
Jelenleg a cisztás fibrózis és hemofília kezelésére szolgáló adeno-asszociált vírusalapú gyógyszerek (vektorok) a klinikai vizsgálatok első szakaszán mennek keresztül. Ígéretes eredmények születtek a Parkinson-kór elleni gyógyszerekkel kapcsolatos klinikai vizsgálatok első fázisában . Más klinikai vizsgálatok kimutatták az adeno-asszociált vírusvektorok biztonságosságát Canavan-kórban , izomdisztrófiában és Bilshovsky-Jansky
Betegség | Gén | Az adagolás módja | Teszt fázis | A tesztalanyok száma | Állapot |
---|---|---|---|---|---|
cisztás fibrózis | CFTR | Tüdő, aeroszol | én | 12 | Befejezve |
CFTR | Tüdő, aeroszol | II | 38 | Befejezve | |
CFTR | Tüdő, aeroszol | II | 100 | Befejezve | |
Hemofília B | FIX | Intramuszkuláris | én | 9 | Befejezve |
FIX | máj artéria | én | 6 | Befejezett | |
Ízületi gyulladás | TNFR:Fc | Intraartikuláris | én | egy | Folytatni |
örökletes emphysema | AAT | Intramuszkuláris | én | 12 | Folytatni |
izomsorvadás | szarkoglikán | Intramuszkuláris | én | tíz | Folytatni |
Parkinson kór | GAD65, GAD67 | a koponya belsejében | én | 12 | Befejezve [13] |
Canavan betegség | AAC | a koponya belsejében | én | 21 | Folytatni |
Batten betegség | CLN2 | a koponya belsejében | én | tíz | Folytatni |
Alzheimer-szindróma | NGF | a koponya belsejében | én | 6 | Folytatni |
spinális izomsorvadás | SMN1 | intratekális | I–III | tizenöt | Számos próba befejeződött, több folyamatban van ( Zolgensma ) |
A prosztatarák kezelésére irányuló klinikai vizsgálatok 2005-ben a III. stádiumban vannak [12] , azonban ezek az ex vivo vizsgálatok nem tartalmazzák az ADV betegeknek történő közvetlen beadását.
Az adeno-asszociált vírus nem okoz betegséget emberben. Ez a vírus azonban a férfi meddőség kockázati tényezőjének bizonyult [14] . Az adeno-asszociált vírusok genomiális DNS-e olyan spermamintákban található, amelyekben károsodott a spermiumok szerkezete és funkciója . Azonban nem találtak közvetlen kapcsolatot e fertőzés és a férfi meddőség között.
A hepatocelluláris karcinóma ritka formáiban szenvedő betegeken végzett közelmúltbeli tanulmányok arra utalnak, hogy az AAV2 vírus szerepet játszhat a rák kiváltó okaiban. Mivel az AAV2 vírus olyan géneket céloz meg, amelyek fontos szerepet játszanak a sejtszaporodásban, a kutatók úgy vélik, hogy a fertőzés túlaktiválódáshoz vezet, ami tumornövekedést eredményez. Ez a felfedezés megkérdőjelezi az AAV2 vírusok génterápiás alkalmazásának biztonságosságát [15] .
Az adeno-asszociált vírus genomja körülbelül 4,7 ezer nukleotid hosszúságú (+ vagy -) egyszálú DNS -t (ssDNS) tartalmaz. A genomiális DNS-molekula végein fordított terminális ismétlődések ( ITR -ek ) találhatók . A genom két nyitott leolvasási keretet ( ORF ) tartalmaz : rep és cap . Az első négy átfedő gént tartalmaz, amelyek Rep fehérjéket kódolnak, amelyek szükségesek a vírus életciklusához , a második leolvasási keret a kapszid fehérjék átfedő nukleotid szekvenciáit tartalmazza : VP1, VP2 és VP3, amelyek a kapszid ikozaéder fejét alkotják [16] .
A fordított terminális ismétlődések szekvenciája ( eng. Inverted Terminal Repeat, ITR ) 145 nukleotidból áll. Az ITR-ek szimmetrikusan helyezkednek el az adeno-asszociált vírusok genomjában, és szükségesek a genomi DNS - replikációhoz [17] . Az ITR másik tulajdonsága a hajtűk kialakításának képessége, amely lehetővé teszi a DNS második szálának szintézisét primáz részvétele nélkül . Fordított terminális ismétlődésekre van szükség a vírus DNS-ének a tizenkilencedik emberi kromoszóma egy specifikus régiójába történő integrálásához és a provírus DNS kromoszómából való felszabadulásához [18] [19] , valamint adeno-asszociált komplexek képződéséhez. vírus DNS dezoxiribonukleáz-rezisztens burokfehérjékkel [20] .
Génterápia esetén az ITR-nek a terápiás gén után cisz pozícióban kell lennie. Ezt a mintát alkalmazzák adeno-asszociált víruson ( eng. rekombináns AAV, rAAV ) alapuló rekombináns vektorok előállítására, amelyek riporter- vagy terápiás géneket tartalmaznak. Kimutatták, hogy a replikációhoz és a kapszid hajtogatáshoz nincs szükség ITR-ekre a cisz pozícióban. A rep gén nukleotidszekvenciájában egy cisz -hatású Rep-függő elemet (CARE ) találtak . A cisz helyzetben a CARE fokozza a vírusrészecskék replikációját és összeállítását [21] [22] [23] [24] .
Gének és fehérjék repA „ genom bal oldala ” két promotert tartalmaz , a p5-et és a p19-et, amelyekből két különböző hosszúságú , egymást átfedő mRNS íródik át . Minden, a megfelelő mRNS-t kódoló gén tartalmaz egy intront , amely a splicing folyamat során kivágható . Ennek eredményeként négy különböző mRNS szintetizálható, és ennek megfelelően négy különböző Rep fehérje átfedő szekvenciákkal. A fehérjéket kDa -ban kifejezett molekulatömegük alapján nevezik el : Rep78, Rep68, Rep52 és Rep40 [25] . A Rep78 és 68 specifikusan primerként köt egy hajtűt, amelyet fordított terminális ismétlődések alkotnak, majd levágják a terminális felbontás helyén . Kimutatták, hogy a Rep78 és 68 szükséges az adeno-asszociált vírus DNS specifikus integrációjához a gazda genomjába. Négy Rep fehérje köti az ATP-t és helikáz aktivitással rendelkezik. Ezek a fehérjék fokozzák a p40-promóterből történő transzkripciót, de gyengítik a p5- és p19-promoterek transzkripcióját [19] [25] [26] [27] [28] [29] .
cap gének és VP fehérjékAz adeno-asszociált vírus genomiális DNS -ének (+) szálának „jobb oldala” átfedő szekvenciákat tartalmaz, amelyek három kapszidfehérjét kódolnak, a VP1-et, VP2-t és VP3-at. Ezeknek a géneknek a transzkripciója egyetlen promoterből , a p40- ből indul ki . A megfelelő fehérjék molekulatömege 87 , 72 és 62 kDa [30] . Mindhárom fehérje ugyanabból az mRNS-ből transzlálódik. A transzkripciót követően a pre-mRNS két különböző módon spliced, miáltal egy hosszabb vagy rövidebb intron kivágásra kerül, és 2300 vagy 2600 nukleotidból álló mRNS jön létre . Általában, különösen adenovírus jelenlétében , egy hosszabb intront vágnak ki. Ebben a formában az első startkodon AUG kivágásra kerül , amelyből a VP1 fehérje szintézise megindul, és a VP1 fehérje szintézis szintje csökken. Az első kodon , amely hosszabb transzkriptumAUG esetén megmarad, a VP3 fehérje startkodonja. Azonban az ugyanabban a leolvasási keretben ezt a kodont megelőző nukleotidszekvencia tartalmazza a treonint kódoló szekvenciát , amelyet az optimális Kozak-szekvencia vesz körül . Ez a VP2 fehérje szintézisének csökkenéséhez vezet (amely egy VP3 fehérje, amely további aminosavakat tartalmaz az N-terminálison [31] [32] [33] [34] . ACG
Mivel a nagyobb intron előnyösen kivágásra kerül a pre-mRNS-ből, és mivel a kodon ACGegy gyengébb startkodon, a megfelelő fehérjék in vivo körülbelül 1:1:20 arányban expresszálódnak, és a fehérjék is benne vannak a vírusrészecskében. ugyanilyen arányban [35] . A VP1 fehérje N-terminálisán található egyedi fragmentum foszfolipáz A2 ( PLA2 ) aktivitással rendelkezik , amely valószínűleg szükséges a vírusrészecskék késői endoszómákból való felszabadulásához [36] . Muralidar és munkatársai kimutatták, hogy a VP2 és VP3 fehérjék nélkülözhetetlenek egy vírusrészecske összeállításához [33] . Warrington és munkatársai kimutatták, hogy a VP2 fehérje nem feltétlenül szükséges egy vírusrészecske összeállításához, és nem befolyásolja a vírus patogén tulajdonságait. A VP2 fehérje működését azonban nem befolyásolják az N-terminális részbe történő jelentős inszerciók, míg a VP1-be történő inszerciók csökkentik a foszfolipáz aktivitását [37] .
A VP3 fehérje kristályszerkezetét 2002-ben Xi és Bew és munkatársai határozták meg [38] .
2006 -ig 11 adeno-asszociált vírus szerotípust írtak le [39] . Az összes ismert szerotípus számos szövettípusban képes megfertőzni a sejteket . A szövetspecifitást a kapszidfehérjék szerotípusa határozza meg , ezért az adeno-asszociált vírusvektorokat úgy tervezték, hogy meghatározzák a kívánt szerotípust.
Az adeno-asszociált vírus 2-es szerotípusát tanulmányozták a legszélesebb körben [40] [41] [42] [43] [44] [45] . Az adeno-asszociált vírus 2-es szerotípusa természetes affinitást mutat a vázizmokhoz [46] , a neuronokhoz [40] , a vaszkuláris simaizomhoz [47] és a hepatocitákhoz [48] .
Három sejtes receptort írtak le az adeno-asszociált vírus 2-es szerotípusára: heparán -szulfát proteoglikán (HSPG ) , integrin a V β 5 és fibroblaszt növekedési faktor receptor 1 ( FGFR-1 ) . Az előbbi az elsődleges receptor, az utóbbi kettő a társreceptor, és lehetővé teszi az adeno-asszociált vírus bejutását a sejtbe receptor által közvetített endocitózissal [49] [50] [51] [52] . A HSPG jelentős mértékben jelen van az extracelluláris anyagban, és elsődleges receptorként működik, miközben megtisztítja a szervezetet az adeno-asszociált vírusrészecskéktől és csökkenti a fertőzés hatékonyságát [53] .
Tanulmányok kimutatták, hogy az adeno-asszociált vírus 2-es szerotípusa elpusztítja a rákos sejteket anélkül, hogy károsítaná az egészséges sejteket. "Tanulmányaink kimutatták, hogy a 2-es típusú adeno-asszociált vírus, amely nagy sejtpopulációt fertőz meg, sokféle rákos sejtet elpusztít, de az egészséges sejteket nem" - mondja Craig Meyer , a Penn State College of Medicine immunológia és mikrobiológia professzora. Pennsylvania [54] . Ezek a vizsgálatok új rákellenes gyógyszerek létrehozásához vezethetnek.
Bár az adeno-asszociált vírus 2-es szerotípusa a legnépszerűbb szerotípus a tudományos kutatásban, más szerotípusokról kimutatták, hogy hatékonyabb génszállító vektorok . Például az adeno-asszociált vírus 6-os szerotípusa jobban megfertőzi a légúti hámsejteket, a 7-es szerotípusú vírus nagyon magas szintű transzdukciót mutat az egér vázizomsejtjeivel, a 8-as szerotípusú vírus pedig jól transzdukálja a májsejteket [55] [56] [57] , az 1-es és 5-ös szerotípusú vírusok pedig nagyon hatékonyak, géneket szállítanak az ér endothel sejtjébe [58] . Az adeno-asszociált vírus 6-os szerotípusa, amely az 1-es és 2-es szerotípus hibridje [57] , szintén alacsonyabb immunogenitású, mint a 2-es szerotípusú vírus [56] .
A szerotípusok különböznek abban a receptorban, amelyhez kötődnek. Például a 4-es és 5-ös szerotípusú vírusok transzdukciója gátolható sziálsavoldattal [59] , míg az 5-ös szerotípusú vírus a vérlemezke növekedési faktor receptorán keresztül jut be a sejtekbe [60] .
Az adeno-asszociált vírus különösen érdekes a génterápia számára, mivel korlátozott mértékben képes immunválaszt kiváltani emberben. A vírus ezen tulajdonsága különösen alkalmassá teszi transzdukcióra , mivel csökkenti az immunpatológiák kockázatát.
Az állatok veleszületett immunválaszt mutatnak az adeno-asszociált vírusra. A vírus egereknek történő intravénás beadása gyulladásos citokinek termelését, neutrofilek és más leukociták májba való beszivárgását okozza , ami a jelek szerint jelentősen csökkenti az injektált vírusrészecskék számát [61] .
Kimutatták, hogy a vírus humorális választ okozhat állatokban és emberekben is. Az emberi populáció akár 80%-a 2-es szerotípusú szeropozitív Bebizonyosodott, hogy a neutralizáló antitestek többféle beadási móddal csökkenthetik az adeno-asszociált vírusvektorok transzdukcióját [62] .
A vírusra és a vírusból származó vektorokra adott sejtes immunválaszt 2005 -ig nem ismerték jól [62] . A hemofília B kezelésére szolgáló, adeno-asszociált vírus 2-es szerotípusán alapuló vektor klinikai vizsgálatai kimutatták, hogy a transzdukált sejtek elpusztulhatnak [63] . Tanulmányok kimutatták, hogy a CD8+ T-limfociták képesek felismerni az adeno-asszociált víruskapszid elemeit in vitro [64] , ami a T - limfocitákhoz képest a vektorokra adott citotoxikus válasz lehetőségét jelzi . Ezek a vizsgálatok azonban nem teljesek, és az ilyen citotoxikus válasz lehetőségét nem tárták fel teljesen.
Az adeno-asszociált vírus életciklusában a sejtfertőzés szakaszától az új vírusrészecskék kialakulásáig több szakasz különböztethető meg:
Néhány lépés a cella típusától függően eltérő lehet. A vírus DNS-replikációjának paraméterei az azonos típusú sejtek között is eltérhetnek a sejtciklus szakaszától függően [65] .
Az adeno-asszociált vírus nem képes replikálódni olyan sejtekben, amelyek nem fertőzöttek adenovírusokkal . A vírusrészecskék képződésének ez a tulajdonsága azt jelzi, hogy az adeno-asszociált vírus adenovírusokból származik. Kimutatták, hogy az adeno-asszociált vírus DNS-replikációja elősegíthető bizonyos adenovírusokból származó fehérjék [66] [67] vagy más vírusok, például herpes simplex [68] vagy genotoxikus ágensek, például ultraibolya sugárzás vagy hidroxi- karbamid [69] [70 ] jelenlétében. ] [71] .
Az adeno-asszociált vírusok szaporodásához szükséges minimális adenovírus-génkészletet Matsushita és Ellinger és munkatársai írták le [66] . Ez a felfedezés lehetővé tette olyan rekombináns adeno-asszociált vírusok létrehozását, amelyek nem igénylik az adenovírussal való együttes fertőzést. Helper vírusok vagy genotoxikus faktorok hiányában az adeno-asszociált vírus DNS episzómális formában inszertálható a gazda genomjába. Az első esetben a Rep78 és Rep68 fehérjék hajtják végre az integrációt a gazda genomjába, és a beillesztett szekvenciát szegélyező fordított terminális ismétlődések ( ITR ) jelenléte szükséges . Egerekben az adeno-asszociált vírusgenom episzómaként (körkörös DNS, fejtől farokig orientáció) elhelyezkedhet nem osztódó szövetekben – például a vázizomzatban [72] .