A STARR-Seq ( self-transcribing active regulatory region szekvencia ) egy olyan módszer, amellyel egyidejűleg több millió DNS- szekvencia enhanszeraktivitását lehet elemezni tetszőleges organizmusok genomjából . A STARR-seq nagy teljesítményű, és felhasználható az egész genomra kiterjedő keresésre és az enhanszer aktivitás mennyiségi meghatározására [1] .
Az eukariótákban a transzkripciót transzkripciós faktorok szabályozzák - olyan fehérjék , amelyek a génpromoterekben lévő specifikus DNS-régiókhoz kötődnek, valamint olyan régiókhoz, amelyek nem találhatók a gének közvetlen közelében, beleértve az enhanszereket is . Az enhancerek a DNS nem kódoló régiói, amelyek különféle transzkripciós faktorokhoz specifikus kötőhelyeket tartalmaznak [ 2] . Az enhancerek olyan transzkripciós faktorokat toboroznak, amelyek aktiválják az RNS-polimeráz II -t és az általános transzkripciós faktorokat a promoter közelében, ami géntranszkripcióhoz vezet. Az enhancerek szövetspecifikus módon szabályozhatják a célgének transzkripcióját [1] , függetlenül a DNS-ben való elhelyezkedésüktől és a génpromotertől való távolságuktól. Egyes esetekben képesek szabályozni egy másik kromoszómán található gének transzkripcióját [3] . Mindeddig azonban az információ csak kisszámú enhanszer vizsgálatára korlátozódott a genomszintű keresés összetettsége miatt [2] . Emellett számos szabályozóelem kizárólag meghatározott sejttípusokban és bizonyos körülmények között működik [4] .
A Drosophila enhanszereinek meghatározására egy olyan technikát alkalmaznak, amely egy minimális promótert kódoló transzpozon véletlenszerű beépítését alkalmazza egy riporterfehérjével . Ez a módszer információt nyújt az inszerciós hely közelében található gének enhanszerekkel történő szabályozásáról [5] .
Az elmúlt néhány évben az aktív és inaktív fokozók különféle tulajdonságait tanulmányozták posztgenomikus technológiák segítségével. Az olyan új módszerek kifejlesztése, mint a DNase-seq , FAIRE-Seq , ChIP-seq , lehetővé tette az enhanszerek genomban elfoglalt helyzetének előrejelzését. A DNáz-seq és a FAIRE-seq azonban nem teszi lehetővé az enhanszer és annak aktivitásának közvetlen meghatározását. Ezenkívül ezekkel a módszerekkel nem lehet nagyszámú jelölt szekvenciát tesztelni az enhanszer aktivitás jelenlétére. A STARR-seq fejlesztése lehetővé teszi az enhanszerek genomszintű keresését és aktivitásuk számszerűsítését [1] .
A STARR-seq ötletét A. Stark (A. Stark, Institute of Molecular Pathology , Bécs , Ausztria ) laboratóriumában javasolták tetszőleges organizmusok fokozóinak genomszintű kutatására, valamint a tevékenységük mennyiségi meghatározása. A módszer azon a tényen alapszik, hogy az enhanszerek a DNS-en való relatív elhelyezkedésüktől függetlenül működhetnek. A módszer lényege, hogy a minimális promóter után a potenciális enhanszert helyezzük el, ami lehetővé teszi, hogy az aktív enhanszer aktiválja a saját szekvenciát tartalmazó DNS transzkripcióját. Minden egyes enhanszer aktivitását az RNS -nek az enhanszer szekvenciával való feldúsításának mértéke jellemzi az összes sejt RNS között. Ezzel a megközelítéssel lehetővé válik egyidejűleg több millió DNS-szakasz ellenőrzése tetszőleges forrásból [1] .
A genomi DNS véletlenszerűen apró töredékekre oszlik. Egy bizonyos hosszúságú töredékeket kiválasztunk, adaptereket kötünk hozzájuk. Az adapterekkel ellátott DNS-fragmenseket ezután amplifikáljuk . A PCR - termékeket megtisztítják és a plazmidba a minimális promóter után inszertálják a riportergén 3'-irányban nem transzlálódó régiójában , lehetővé téve az aktív enhanszer számára, hogy aktiválja egy olyan DNS-régió RNS-polimeráz általi transzkripcióját , amely a transzkripció kezdőpontja után tartalmazza a szekvenciát. magáról a fokozóról. A sejteket ezután a kapott riporterkönyvtárral transzfektáljuk, és tenyésztjük. A poliadenilált RNS-t a teljes RNS-ből izolálják, és a cDNS-t reverz transzkripcióval nyerik, amelyet amplifikálnak, majd a fragmensek szekvenciáját páros végű szekvenálással ismerik fel . A szekvenált fragmentumokat a referencia genomhoz térképezzük , és az adatokat számítógépes feldolgozásra küldjük [1] .
A STARR-seq módszert eredetileg a Drosophila genomra alkalmazták . Azt találták, hogy az enhanszerek többsége (55,6%) az intronokban található , különösen az első intronban és az intergenikus régiókban. Érdekes, hogy az enhanszerek kis része (4,5%) található a transzkripció starthelyein, ezért feltételezhető, hogy ezek az enhanszerek ezen a helyen is beindíthatják a transzkripciót és befolyásolhatják más gének transzkripcióját. A legaktívabb fokozók a konstitutív gének , például a citoszkeletális fehérjéket kódoló gének és egyes fejlődési szabályozók, például a transzkripciós faktorok közelében találhatók. A szerzők kimutatták, hogy sok gént több független aktív enhanszer szabályoz. Emellett kiderült, hogy a génexpresszió szintjei átlagosan korrelálnak a génenkénti teljes enhanszer aktivitással, ami közvetlen összefüggést biztosít az expresszió szintje és az enhanszer aktivitás között [1] .
A STARR-seq segítségével szabályozó allélvariánsok keresésére és jellemzésére Vockey és munkatársai 95 egyed genomjából származó 100 feltételezett enhanszer aktivitásának mérésével fedezték fel az emberi genetikai variáció hatását a nem kódoló szabályozóelemek működésére. Ez a megközelítés lehetővé teszi a genomi lókuszokban található szabályozó variánsok (beleértve az SNP -ket) azonosítását, amelyek hozzájárulnak a különböző mRNS -ek expressziós szintjének változásához ( eQTL ), valamint hozzájárulnak a komplex fenotípusok kialakulásához [7] .
A STARR-seq módszernek a következő előnyei vannak:
A STARR-seq a molekuláris biológia klasszikus módszereit ötvözi a rendkívül speciális bioinformatikai módszerekkel az enhanszer aktivitás kimutatására és mennyiségi meghatározására. A mai napig a STARR-seq-et egér- és emberi sejtekben alkalmazták, és hatékonyságát megerősítették [8] . A STARR-seq alkalmazása különféle organizmusok különféle sejttípusaira jelentős lépést tesz lehetővé a génszabályozás és az ezért felelős jelátviteli útvonalak tanulmányozásában a fejlődés és a sejtdifferenciálódás során , normál és patológiás körülmények között . ] .