A páros végű szekvenálás az egyik új generációs DNS szekvenálási módszer , amely egy páros végű címkék (PET ) könyvtárának beszerzésén és szekvenálásán alapul , amelyben a DNS/cDNS fragmensek rövid 5'- és 3'-terminális régiói kapcsolódnak egymáshoz. más.egy baráttal.
Két fő módszer létezik a párosított végfragmensek könyvtárainak létrehozására: klónozással és klónozás nélkül [1] .
A genomi DNS fragmentáción megy keresztül (bármilyen módszerrel: restrikciós endonukleázokkal, ultrahanggal, porlasztással). A speciális endonukleázokhoz, például MmeI-hez vagy EcoP15I-hez restrikciós helyeket tartalmazó adaptereket DNS- fragmensekhez ligáljuk . Az adapterekkel ellátott fragmentumokat bakteriális vektorba ligálják . Az E. coli sejteket ezután a ligációs eleggyel transzformáljuk . A kapott baktériumkolóniákból külön plazmidokat tisztítunk, és az egyik speciális restrikciós endonukleázzal kezeljük, amelynek helyeit az adapterek tartalmazzák. Ezek az endonukleázok kivágják a klónozott DNS-fragmensek központi részét, így a végszakaszok elhagyják. Miután ezeket a szakaszokat egymáshoz kötjük, páros végfragmensek képződnek. Ezeket a páros végfragmenseket standard restrikciós endonukleázzal hasítjuk, amelynek helyei a klónozott adapterek szélein vannak. A következő szekvenálási technika megválasztásától függően a páros végfragmensek szekvenciái monomerként, dimerként vagy konkatemerként (több fragmentum összekapcsolva) használhatók.
A DNS-fragmentum metilált, hogy megvédje magát a restrikciós endonukleázok hatásától . A fragmens végei "tompává" vannak, és az 5' végét foszforilezik. Ezekre a manipulációkra azért van szükség, hogy (metilálatlan) adaptereket varrjunk a DNS-fragmens végeihez. Ezek az adapterek restrikciós helyet tartalmaznak, és biotinilezhetők is. A kapott DNS-fragmenseket, amelyeket adapterek szegélyeznek, körkörössé alakítjuk. Ha az adapterek nem lettek biotinilezve, akkor a ciklizálás során hozzáadható egy biotinilezett „belső” adapter. A biotint a célpáros végfragmensek izolálására használják sztreptavidint tartalmazó szorbensen. A cirkuláris DNS-molekulát az MmeI vagy EcoP15I endonukleáz dolgozza fel, amelyek kötőhelyeit az adapterek tartalmazzák. Szabad PET jön létre. A szekvenálás előtt az adaptereket összevarrják ezekhez a páros végfragmensekhez, amelyek a PCR primerek összekapcsolásához szükséges szekvenciákat tartalmazzák. A PET amplifikálására polimeráz láncreakciót (PCR) használnak [2] .
A klónozással történő könyvtár létrehozásának előnye az eredeti, teljes hosszúságú cDNS-fragmensek megőrzése. A klónozás azonban hosszú és fáradságos folyamat. A legnépszerűbb módszer a klónozás nélküli módszert nyerte el. A párosított végfragmensek tag szekvenciáinak hossza eltérő lehet. A hosszabb címkék megkönnyítik az olvasmányok leképezését . A fent leírt fragmentumok létrehozásához használt endonukleázok (MmeI vagy EcoP15I) 18/20 bp-os jelöléseket adnak. és 25/27 bp [3] . Ezeknek az endonukleázoknak az a sajátossága, hogy kötőhelyük alatt szakadást vezetnek be a DNS-láncban. A kapott páros végfragmenseket a következő generációs szekvenáláshoz használjuk ( SOLiD , Illumina, 454 Life Sciences). Hosszabb jelölések nyerhetők más DNS-linearizációs módszerekkel a DNS-fragmens ciklizálási lépése után. Az illesztett végű szekvenálás fő előnyei az egycímkés megközelítésekkel szemben (vagyis a DNS-fragmensnek csak az egyik végét jelölik meg) az alacsonyabb költségek, a megnövekedett olvasási térképezés specifitás és a genom szerkezeti jellemzőinek meghatározásának képessége.
A páros végfragmensek de novo genomszekvenáláshoz való alkalmazása számos előnnyel jár. Ezt a fajta szekvenálást páros végsorozatnak vagy „kétcsövű shotgun szekvenálásnak” nevezik. A legnépszerűbb megközelítést 1995 -ben javasolták [4] , ami az 1991-ben leírt szekvenálási stratégia továbbfejlesztése volt [5] .
A következő generációs szekvenálási technológiák lehetővé teszik a DNS-minta nagyon gyors és gazdaságos leolvasását, de az így kapott leolvasások hossza jóval rövidebb a Sanger-módszerrel végzett szekvenáláshoz képest . A genomok összeállítása, különösen az olyan összetett, mint az eukarióta genomok , rövid fragmentumokból összetett probléma. A nagyszámú rövid szekvenciánál felmerül a kérdés, hogyan lehet ezeket a megfelelő irányba orientálni és összekapcsolni, hogy teljes genomot kapjunk. Az ismétlődések jelenléte a genomban tovább bonyolítja ezt a feladatot. A probléma megoldása a páros végtöredékek alkalmazása lehet.
A DNS-fragmens hosszának, és így a címkék közötti távolság változtatásával kiválasztható egy olyan távolság, amely nagyobb, mint az ismétlődő szakasz. Ennek eredményeként az olvasási leképezés egyértelművé válik. A páros végű szekvenálási technológia lehetővé teszi a "kétértelmű" leolvasások (vagyis azok, amelyek a genomban több helyhez rendelhetők) használatát a genom összeállításához. Ez növeli a hatékonyságot, miközben csökkenti a szekvenálás költségeit, mivel ezeket a kétértelmű szekvenciákat vagy leolvasásokat általában elvetik, és nem veszik figyelembe az összeállítás során.
A párosított DNS-végek szekvenálásának módszere lehetővé teszi a genomban előforduló szerkezeti eltérések kimutatását: inszerciók, deléciók , inverziók és transzpozíciók. A párosított végfragmensek könyvtárának létrehozásakor azonos hosszúságú DNS-fragmenseket választunk ki, például 3 kb. [6] . A fennmaradó standard lépések (lásd fent) elvégzése után megkapjuk a könyvtárat. Az eredményül kapott leolvasásokat sorba rendezzük és leképezzük. A referenciagenomhoz való leképezéskor az egyetlen DNS-fragmensből származó címkéknek körülbelül 3 kb távolságra át kell fedniük a referenciagenomot. (ezt a távolságot a könyvtár felépítésekor állítjuk be) egymástól és meghatározott tájolásban. Tehát, ha a címkék közötti távolság kisebb, mint 3 kb, ez deléció jelenlétét jelzi a szekvenált genomban, ha több, akkor inszerciót. A genom szerkezeti variációira bonyolultabb példákat kaphatunk, ha figyelembe vesszük az "inkonzisztens" címke-leképezési helyeket (pl. egy szekvencia beillesztése egy másik lókuszból) [2] [6] .
A genom szerkezeti változatainak összehasonlítása két emberben (az afrikai és kaukázusi faj képviselője) a teljes szerkezeti eltérés körülbelül 50%-ának jelenlétét mutatta ki. A szerkezeti eltérések "forró pontjai" gyakran a genom bizonyos betegségekkel kapcsolatos helyein találhatók. A strukturális eltérések befolyásolják a genom szerveződését, mivel biztosítják az exonok mozgását, a gének "fúzióját", a gén orientációjának megváltoztatását vagy amplifikációját [6] .
A DNS páros végeinek szekvenálásának módszerét a rákos sejtek genomiális átrendeződéseinek feltérképezésére is alkalmazták [7] .
A módszert teljes hosszúságú mRNS -ek azonosítására használják a megfelelő cDNS -könyvtár 5' és 3' végének szekvenálásával [8] [9] . ábrán. 3. bemutatjuk a módszer általános sémáját. A páros végfragmensek könyvtárának kinyerése cDNS klónozás nélküli PCR-rel lehetővé teszi nehezen klónozható mRNS vagy nagyon alacsony koncentrációjú mRNS felvételét az elemzésbe. Ezután a könyvtárat olyan modern szekvenszerekkel szekvenálják, mint az Illumina GA vagy a SOLiD v4.
Az RNS páros végeinek szekvenálását a transzkriptom kvalitatív és kvantitatív elemzésére használják : alternatív transzkripciós kezdetek , poliadenilációs helyek meghatározása és a génexpressziós profil meghatározása. A módszer kiméra gének és transzsplicing esetek azonosítására is használható , azonban ezek az adatok további kísérleti ellenőrzést igényelnek.
A párosított RNS-végek szekvenálásának előnye az mRNS 5'- és 3'-végeinek azonosítására szolgáló más módszerekhez, például a CAGE -hoz , SAGE -hoz és SuperSAGE -hoz képest az mRNS mindkét végének egyidejű kimutatása, ami nagyobb pontosságot biztosít. a megfelelő mRNS feltérképezésében a genomon. A teljes genom RNS szekvenálás módszerétől eltérően , amely véletlenszerűen kapott RNS-fragmensek könyvtárát elemzi, az RNS páros végű szekvenálás csak az RNS-molekulák végeinek szekvenciáját határozza meg, ami jelentősen csökkenti a transzkriptom kvantitatív elemzésének költségeit, de nem. információkat nyújtanak az mRNS belső szerkezetéről, például a polimorfizmusok helyzetéről vagy az exon - intron szerkezetéről. Ezenkívül a stabil mRNS másodlagos struktúrák megnehezíthetik a teljes hosszúságú cDNS előállítását, és ezáltal az mRNS azonosítását.
A Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) egy molekuláris biológiai módszer, amely lehetővé teszi az egymástól jelentős távolságra lévő kromatin régiók kölcsönhatásának (térbeli közelségének) meghatározását a genomban lévő baráttól. Ez a módszer lehetővé teszi a kromatin régiók egymáshoz viszonyított térbeli elrendezésének de novo meghatározását. Az ilyen kölcsönhatások a szabályozó elemek (pl. cisz-szabályozó elemek, transzregulációs elemek, szigetelők , fokozók , hangtompítók ) meghatározása szempontjából érdekesek. A kapott információk viszont fontosak a génexpresszió szabályozási mechanizmusainak megértéséhez .