A Sanger -módszer egy DNS - szekvenálási módszer , más néven lánclezáró módszer. Ezt a szekvenálási módszert először Frederick Sanger javasolta 1977-ben [1] , amiért 1980 -ban kémiai Nobel-díjat kapott . Ez a módszer 40 éve a legelterjedtebb.
A Sanger-módszer klasszikus változatában az elemzett DNS egyik szála templátként működik a komplementer szál DNS-polimeráz enzim általi szintéziséhez . A reakciót ugyanazzal a mátrixszal négy különböző csőben hajtják végre, amelyek mindegyike tartalmazza:
A didezoxiribonukleotidokból (ddATP, ddGTP, ddCTP vagy ddTTP) hiányzik a 3'-hidroxilcsoport, így a további szintézis megszakad a láncba kerülésük után. Így minden csőben különböző hosszúságú DNS-fragmensek halmaza keletkezik, amelyek ugyanabban a nukleotidban végződnek (a hozzáadott didezoxinukleotid szerint). A reakció befejeződése után a csövek tartalmát poliakrilamid gélelektroforézissel denaturáló körülmények között elválasztjuk, és a géleket autoradiografáljuk . Négy reakció termékei alkotnak egy "szekvenáló létrát", amely lehetővé teszi egy DNS-fragmens nukleotidszekvenciájának "leolvasását" [2] [1] .
A Sanger-módszer lehetővé teszi az RNS nukleotid-szekvenciájának meghatározását is, de először reverz transzkripció segítségével "át kell írni" DNS formájában .
A mai napig a Sanger szerinti DNS-szekvenálás teljesen automatizált, és speciális eszközökön, szekvenálókon történik. A különböző emissziós hullámhosszúságú fluoreszcens jelölésű didezoxinukleotidok alkalmazása lehetővé teszi a reakció egy kémcsőben történő végrehajtását. A reakcióelegyet oldatban kapilláris elektroforézissel elválasztjuk, a kapillárisoszlopból kilépő DNS-fragmenseket fluoreszcens detektorral rögzítjük . Az eredményeket számítógéppel elemezzük, és négy nukleotidnak megfelelő színes csúcsok sorozataként mutatjuk be. Az ilyen típusú szekvenátorok 500-1000 nukleotid hosszúságú szekvenciákat tudnak egy időben "olvasni". Összehasonlításképpen, az 1996-ban kifejlesztett piroszekvenálási módszer lehetővé teszi egy lépésben sokkal kisebb számú nukleotid szekvenciájának meghatározását. Az automatizálás nagymértékben felgyorsította a szekvenálási folyamatot, és lehetővé tette teljes genom szekvenálását , beleértve az emberi genomot is [2] .