A FAIRE-Seq ( Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements szekvencia ) egy molekuláris biológiai módszer , amelyet a DNS [1] [2] szabályozó szekvenciáinak (szekcióinak) meghatározására használnak . A FAIRE-Seq a kromatin szabályozóelem-izoláció (FAIRE) és a nagy áteresztőképességű szekvenálás kombinációja .
A FAIRE a nyílt kromatin régiók feltérképezésének egyik módszere a DNáz I túlérzékeny ( DNáz-seq ) és a kromatin immunprecipitációs ( ChIP-seq , ChIP-on-chip) módszerekkel együtt. A módszer ötletét 2003-ban javasolták a Saccharomyces cerevisiae kromatin 2 részre történő frakcionálására: az első az RNS polimeráz II által átírt régiók, a második a nem kódoló szekvenciák és az RNS polimeráz I vagy III által átírt régiók . 3] . Az elválasztást az egyes kromatin régiók eltérő fokú formaldehid térhálósodása miatt hajtják végre. 2007-ben ezzel a módszerrel azonosították a humán kromatin szabályozó aktivitásával kapcsolatos régiókat; így a módszer átment a teszten és megkapta a FAIRE nevet [4] . Az eredeti változatban az adatelemzés a fluoreszcensen jelölt DNS-fragmensek DNS-microarray -ekkel való hibridizálásán alapult [4] , amelyet később FAIRE-chipnek neveztek el. A későbbi munkákban más módszereket javasoltak a kapott DNS-fragmensek elemzésére, amelyek közül a leggyakoribb a FAIRE-seq [1] .
A mai napig számos változata létezik az állatok és növények szöveteire szánt módszernek. Növényekkel végzett munka során szigorúbb feltételek és hosszú formaldehid rögzítési idő szükséges a sejtfal, a levelek viaszos kutikulája és a szivacsos mezofil légterei miatt [5] . A módszer a szabályozó régiók feltérképezése mellett lehetővé teszi a különböző szövetekben (tumoros és egészséges) lévő aktív elemek összehasonlítását is. A FAIRE-seq használatával végzett kísérletek átlagosan körülbelül három napot vesznek igénybe, nem számítva az adatok elemzését és értelmezését [6] .
Az eukarióta sejtekben az aktív szabályozó régiókban nyitott kromatin figyelhető meg, ezért a nukleoszómákban nem gazdag régiók elkülönítése lehetővé tenné a genom szabályozó elemeinek feltérképezését sejttípustól függetlenül [2] . Ha formaldehidet adnak a szövettenyészethez, keresztkötések jönnek létre a fehérjék , fehérjék és nukleinsavak, különösen a DNS és a hisztonok, vagy a hisztonok között. Ezután a genomi DNS-t ultrahangos fragmentációnak vetik alá átlagosan 300-400 bázispár hosszúságú szegmensekre. Az ezt követő fenol-kloroformos extrakció során a fehérjementes DNS a vizes fázisban lesz, a kovalens kötésű DNS-fehérje komplexek pedig a fázishatáron. Így a genom szabályozó aktivitással összefüggő és nukleoszómáktól mentes (vagy kis számú) régiói a vízben a fázishatár felett helyezkednek el. Innen extrahálhatók, a megmaradt fehérjékből még egyszer fenol-kloroformmal megtisztíthatók, ribonukleáz A-val kezelhetők és további elemzés céljából újra kicsaphatók . Kontrollként ugyanazon szövettenyészetből, azonos eljárásokkal, de formaldehid fixálás nélkül nyert DNS-mintát használnak [6] .
Továbbá, a kapott DNS-szakaszok elemzési módszerétől függően FAIRE-seq (DNS-fragmensek nagy áteresztőképességű szekvenálása, például Illumina segítségével ), FAIRE-chip (fluoreszcensen jelölt DNS-fragmensek hibridizálása DNS-mikroarray -ekkel ), FAIRE-qPCR (DNS-szelvények kvantitatív elemzése PCR-rel valós időben ). Mára a FAIRE-seq szinte teljesen kiszorította a kivont DNS-fragmensek meghatározására szolgáló egyéb módszereket [6] .
A szekvenálási adatok elemzéséhez a szekvenciákat a referenciagenomhoz kell igazítani, amelyhez például Bowtie -t használnak . Ezután jelentős dúsítási régiókat keresnek . Erre a célra a ZINBA használata javasolt. A FAIRE-chippel és a FAIRE-qPCR-rel ellentétben, ha a FAIRE-seq-et megfelelő mélységű genomfedéssel használjuk, előfordulhat, hogy a kontrollminta hiányzik [6] .
A FAIRE-seq segítségével meg lehet keresni a tumorfaktorok célpromotereit , kimutatni és tesztelni a szabad kromatin potenciális régióit, amelyek nem kapcsolódnak nukleoszómákhoz, azonosítani a genom indukálható szabályozó régióit, és leírni a genom aktív szabályozó elemeit. A módszer lehetővé teszi a szabályozó régiók nukleotid-összetételének variabilitásának felmérését is a különböző populációkban [7] .
A FAIRE-seq más módszerekkel, például a DNase-seq-vel együtt történő alkalmazása megbízhatóbb és jó minőségű eredményt ad [2] .
A FAIRE módszer nem igényli a sejtek előkezelését, mivel formaldehidet adnak a tápközeghez vagy közvetlenül a szövethez, ami gyorsan sejthalálhoz vezet, ami lehetővé teszi a kromatin fixálás előtti állapotú kinyerését. Ugyanakkor az állandó koncentrációjú formaldehiddel végzett különböző rögzítési idők ugyanazt az eredményt adják. A ChIP -vel [8] ellentétben a módszer nem függ az antitestek megbízhatóságától és variabilitásától. Ezenkívül a FAIRE nem követeli meg olyan enzimek használatát, mint a DNáz vagy MNáz, amelyeket általában hasonló módszerekben használnak a nukleoszómamentes régiók kimutatására. Az enzimes kezelés hiánya miatt ez a módszer kevésbé változékony, megbízhatóbb és reprodukálható [6] .
A FAIRE könnyen adaptálható szövetmintákon való használatra, mivel a FAIRE nem igényel egyetlen sejtszuszpenziót vagy nukleáris izolálást. Ebben az esetben az egyetlen további lépés a fagyasztott szövet durva porrá őrlése a rögzítés előtt [6] .
A FAIRE képes kimutatni a promóterektől távol elhelyezkedő disztális szabályozóelemeket (pl. transzkripciós fokozók), amelyek nem találhatók meg a DNáz-seq- ben [2] .
A kísérleti rész egyszerűsége ellenére a FAIRE-seq a kiterjedt szekvenáláshoz kapcsolódó többi módszerhez hasonlóan jelentős mennyiségű számítási erőforrást és memóriát igényel az eredmények értelmezéséhez. Ebből a szempontból a FAIRE-chip és a FAIRE-qPCR vonzóbb lehet [6] .
A DNase-seq- hez és a ChIP-seq -hez képest a FAIRE alacsonyabb jel-zaj aránnyal rendelkezik. Ezért a FAIRE által észlelt helyek időről időre csak kis mértékben térhetnek el a háttérjeltől, ami csökkenti az azonosított helyek iránti bizalmat. Ez a hatás fokozódik, ha nem szekvencia szerinti kimutatási módszereket alkalmaznak. Az alacsony jel-zaj arány ellenére érdemes megjegyezni, hogy a FAIRE eredmények jó reprodukálhatósággal rendelkeznek . Az aktívan expresszált gének egyes promótereinek kimutatása azonban rosszabb, mint más módszerek, például a DNáz-seq [2] .
A szövetrögzítés hatékonysága a tulajdonságaitól (tisztaság, permeabilitás, sejtsűrűség, zsírtartalom és felület) függően változik, ami megnehezítheti a különböző szövetekre kapott eredmények összehasonlítását [6] .
A FAIRE-seq humán genom adatai az ENCODE (DNS elemek enciklopédiája) projekt részeként érhetők el az interaktív UCSC Genome Browser weboldalon amely hozzáférést biztosít különféle gerinces , gerinctelen és nagy modellszervezetek genomadataihoz , integrálva következetes annotációk [9] .