Nyitott kromatin ( angolul open chromatin ) – kis kromatinterületek , nukleoszómáktól mentes [1] . A nukleoszómák beültetését általában megakadályozzák a kromatinhoz kapcsolódó fehérjefaktorok , amelyek felismernek bizonyos DNS-szekvenciákat . Ezek a fehérjék magukban foglalják a transzkripciós faktorokat , DNS- vagy RNS - polimerázokat . A nyitott kromatin gyakran egybeesik a cisz-szabályozó szekvenciákkal , nevezetesen: promoterekkel , enhanszerekkel , szigetelőkkel , hangtompítókkal , a DNS-replikáció kiindulási helyeivel [2] . A kromatin nyitott szakaszainak mérete általában több száz bázispár , átlagosan körülbelül 300 bp [3] .
A nyílt kromatint leggyakrabban a DNáz-érzékenységi módszerrel határozzák meg. A kromatin nukleoszómamentes régióit elsősorban a DNáz I támadja meg, ha permeabilizált sejteket vagy izolált sejtmagokat kezelünk vele . Ebben a tekintetben a nyílt kromatint gyakran nevezik DNáz I túlérzékeny helyeknek vagy túlérzékeny helyeknek . A túlérzékeny helyeken a DNS nukleáz általi hasításának valószínűsége több száz, sőt ezerszeres is meghaladhatja az átlagot. A nyílt kromatin DNáz I iránti túlérzékenységet meg kell különböztetni az aktívan átíródó gének fokozott általános DNáz érzékenységétől [4] .
Attól függően, hogy milyen fehérjefaktorok kötődnek a DNS-hez, megakadályozzák a nukleoszóma landolást, a DNáz I-re túlérzékeny kromatin régiók lehetnek szövetspecifikusak vagy konstitutívak, azaz különböző útvonalak mentén differenciálódott sejtekben lehetnek jelen.
A nyitott kromatin területeinek feltérképezésére DNáz-érzékenységet ( DNáz I hiperszenzitív ) és a szabályozó elemek formaldehid felhasználásával történő izolálását alkalmazzák . szabályozó elemek formaldehiddel segített elkülönítése (FAIRE) [1] . A DNáz-érzékenységi módszer nem teszi lehetővé annak meghatározását, hogy a nyitott kromatin ezen területe melyik szabályozó hely [1] .
Korábban a DNáz-érzékenységi módszer eredményeinek elemzését Southern blot hibridizációval ( eng. Southern blot ) végeztük. Ez nem tette lehetővé számunkra, hogy nagyszámú helyszínt elemezzünk, és új túlérzékenységi helyeket találjunk. A DNáz-érzékenység elemzése valós idejű PCR-rel (kvantitatív PCR) is elvégezhető . Ez sokkal egyszerűbb, mint a Southern blot hibridizáció, de ennek a módszernek is korlátozott számú elemzési helye van, és nem használható a DNáz I érzékenységi helyek eloszlásának genomszintű vizsgálatára [5] .
A nagy teljesítményű szekvenálási és DNS -microarray módszerek kifejlesztése lehetővé teszi a nyitott kromatin régiók feltérképezését az egész genomban [ 6 ] . Ezen túlmenően, a DNáz-érzékenységi módszer és a Chromatin immunoprecipitation ( ChIP) módszer kombinációja, amelyet nagy áteresztőképességű szekvenálás követ, több információt nyújt a specifikus transzkripciós faktorok aktív kromatin helyekhez való kötődéséről [1] .
A nyitott kromatin területeinek feltérképezésének másik módja a kromatin immunprecipitáció ( ChIP ) elvégzése a hisztonok elleni antitestek kimutatására . Ugyanakkor a nyitott kromatin régióknak gyengén kell lenniük, mivel a nukleoszómák nem kapcsolódnak hozzájuk. A DNáz-érzékenység és a hiszton immunprecipitáció módszere hasonló eredményeket ad [7] .
Az eukarióta genomokban különösen fontosak azok a nem kódoló szekvenciák, amelyek részt vesznek a génexpresszió szabályozásában egy szervezet fejlődésének különböző szakaszaiban vagy különböző szövetekben. A szabályozó régiók felfedezése és jellemzése elengedhetetlenné válik a génexpressziós minták megértéséhez [5] . Tehát az emberi genomban a DNS több mint 95%-a nem kódoló . A szekvenciák ebbe az osztályába a felesleges DNS mellett fontos szabályozó szekvenciák is tartoznak: promóterek, fokozók, hangtompítók, szigetelők vagy kontroll lókuszok ( lókusz szabályozó régiók (LCR) ) . Az ENCODE konzorcium kimutatta, hogy az emberi genom 1%-ában azonosított DNáz I túlérzékenységi helyek a hiszton módosulások , a korai replikációs helyek, a transzkripciós starthelyek és a transzkripciós faktor kötőhelyek markerei [8] . Ezenkívül a nyitott kromatin gyakran társul aktívan átírt, nem kódoló RNS- ekkel [8] .
A nem kódoló szabályozó szekvenciákon kívül a nyitott kromatin aktívan átíródó gének exonjaihoz és intronjaihoz is kapcsolódik. Különösen gyakran a nyitott kromatin ilyen területei egybeesnek a gén első exonjával és intronjával [5] . A nyitott kromatin jelenléte azonban nem elégséges feltétele a génaktivitásnak. A nyílt kromatinnal kapcsolatos, át nem íródó gének „készen állnak” az átírásra ( angolul poised state ) [5] . Így a nyitott kromatin képződése vagy az inaktív állapotba való átmenet fontos a génexpresszió szabályozása szempontjából.
Nem csak a transzkripciós faktorok és más szabályozó fehérjék kötőhelyei lehetnek mentesek a nukleoszómáktól. Egyes DNS-szekvenciák nem képesek a nukleoszómális globulusok köré tekeredni. Ezek olyan szekvenciák, amelyeknek csökkent a rugalmassága, és olyan szekvenciák, amelyek hajlamosak nem kanonikus struktúrákat létrehozni, például hajtűket [9] .
Az UCSC Browser képernyőképe a DNaseI hiperérzékenységi klaszterek helyének kolokalizációját mutatja két gén promoterével. A nyitott kromatin területeit H3 [ hisztonok veszik körül, amelyek a 27. lizin aminosavnál acetilálódnak ( H3K27Ac), amely az aktív kromatin szabályozó régiók, például a promóterek és fokozók jelölése. Emellett a DNáz-túlérzékenységi hely régiójában számos transzkripciós faktor kötőhelye található, amelyek között megtalálható a TBP konzervált transzkripciós iniciációs faktor (ez a TFIID fő része ). Megfigyelhető továbbá az RNS-polimeráz II gyakori kötődése ebben a régióban , amely a fehérjekódoló gének transzkripcióját végzi emberben . A DNáz-túlérzékenység ezen helyét az emlősök körében fokozott konzervativizmus jellemzi ( Eng. Mammal Cons ), ami azt jelenti, hogy ez a szekvencia az evolúció során megmarad , és ennek eredményeként funkcionális jelentősége [8] .
A nukleoszómáktól mentes régiók kialakulása speciális tényezők hatására történik, amelyek a nukleoszómák összeszerelését, szétszerelését és mozgását végzik. A nukleoszómák helyzetének megváltoztatásának folyamatát kromatin remodellingnek nevezik . Ez magában foglalja a kromatin átalakító komplexeket - konzervatív fehérje komplexeket, amelyek az ATP energiafelhasználásával működnek . A kromatin remodelling bizonyos epigenetikai jegyek - hiszton módosítás vagy DNS metiláció - bevezetése után történik . Ha a jelek az aktív kromatinnak felelnek meg (például a H3 hiszton acetilezett 9. lizinje, a H3 hiszton di- és trimetilezett 4. lizinje és még sok más), akkor nyitott kromatin területek képződnek. A hiszton módosulások profilja gyakran határozott eloszlású a DNáz I túlérzékenységi hely körül [5] .
A rendkívül hatékony módszerek lehetővé teszik a nyitott kromatin régiók eloszlásának összehasonlítását ugyanabból a szervezetből származó különböző szövetekben vagy sejttenyészetekben. Egy ilyen összehasonlítás jelentős különbséget tár fel az ilyen régiók genombeli eloszlásában [5] . Ez az ilyen helyek eltérő aktivitását jelzi a különböző szövetekben. Így egy gén promótere és enhanszere az egyik szövetben a nyitott kromatin régióban helyezkedhet el, a másikban pedig nukleoszómák zárhatják le. Ez a különböző szövetekben eltérő génexpressziót jelez, és leginkább a szövetspecifikus génekre jellemző . Ezzel szemben az összes szövetben és sejtvonalban a nyitott kromatin régióban található géneket általában háztartási géneknek nevezik . A DNáz érzékenység profilja a sejtfejlődés és differenciálódás során is változhat. A szövetspecifikus gének aktivitásának azonosításához használja a génontológia definícióját ( eng. Gene Ontology (GO) ) a DNáz-seq végrehajtása után [5] .