Southern blot

Az oldal jelenlegi verzióját még nem ellenőrizték tapasztalt közreműködők, és jelentősen eltérhet a 2022. február 22-én felülvizsgált verziótól ; az ellenőrzéshez 1 szerkesztés szükséges .

Southern blot [1] , Southern blot [2] , Southern blot [2] , Southern blot [3] , Southern blot [3] , Southern blot [4] , Southern blot [3] ( angol.  Southern blot ) egy a molekuláris biológiában használt módszer egy mintában egy specifikus DNS-szekvencia azonosítására. Ez abból áll, hogy az agarózgélben elektroforézissel elválasztott DNS-fragmenseket egy membránszűrőre juttatják, majd egy DNS -próbából ismert szekvenciát detektálnak bennük.hibridizáció vele. A módszer a feltaláló, Edwin Southern angol biológus nevéhez fűződik [5] .

Más blot átviteli technológiák, mint például a Western blot , Northern blot , Southwestern blot , hasonló módszereket használnak, de RNS vagy fehérje kimutatására egy mintában, és a Southern által kidolgozott módszerről nevezték el.

Módszer

  1. Restrikciós endonukleázok (restrikciós enzimek), amelyek a nagy molekulatömegű DNS -t kisebb fragmensekre vágják.
  2. A DNS-fragmenseket agarózgél-elektroforézisnek vetjük alá a hossz-elválasztás céljából.
  3. Ha vannak 15 kb -nál hosszabb DNS-fragmensek . , a gélt átvitel előtt például sósavval kezeljük . Ez a DNS-fragmensek depurinációját okozza, és kisebb darabokra bontja őket, ami megkönnyíti a későbbi átvitelt a membránba.
  4. Abban az esetben, ha a lúgos transzfer módszert alkalmazzuk, az agaróz gélt lúgos oldatba helyezzük , amely denaturálja a DNS kettős hélixet , és megkönnyíti a negatív töltésű DNS kötődését a pozitív töltésű membránhoz a további hibridizációhoz. Ugyanakkor az RNS - maradékok is elpusztulnak .
  5. Egy nitrocellulóz (vagy nejlon ) membránt helyezünk az agarózgél fölé vagy alá. A nyomást közvetlenül a gélre vagy több papírrétegen keresztül fejtjük ki. A sikeres átvitelhez szoros érintkezés szükséges a gél és a membrán között. A puffer kapilláris erők hatására a magas nedvességpotenciálú területről egy alacsony nedvességpotenciálú területre (membrán) kerül. Ebben az esetben a DNS átkerül a gélből a membránba. A polianionos DNS egy pozitív töltésű membránhoz kötődik az ioncsere kölcsönhatások erejével.
  6. A DNS végső rögzítéséhez a membránon az utóbbit hagyományos vagy vákuumkemencében 80 °C hőmérsékletre melegítik két órán át, vagy ultraibolya sugárzással megvilágítják (nylon membránok esetén).
  7. Végezzen hibridizációt egy radioaktívan vagy fluoreszcensen jelölt DNS-próbán, amely előre meghatározott DNS-szekvenciával rendelkezik egy membránnal.
  8. A hibridizáció után a felesleges DNS-próbát lemossuk a membránról, és a hibridizációs mintát röntgenfilmen autoradiográfiával ( radioaktív próba esetén) vagy a membrán festődését értékeljük (kromogén festés esetén) .

Eredmények

A próba hibridizációja egy specifikus DNS-fragmenssel a szűrőmembránon azt jelzi, hogy ez a fragmentum a próba nukleotidszekvenciájával komplementer DNS-szekvenciát tartalmaz.

Alkalmazás

A restrikciós endonukleázokkal kezelt genomi DNS -en végrehajtott Southern-blot- vizsgálat felhasználható a genomban lévő gének kópiaszámának meghatározására . Az a próba, amely csak egyetlen, restrikciós enzimekkel nem hasított DNS-fragmenshez hibridizál, egyetlen sávot hoz létre a Southern-bloton, míg a több sáv a bloton azt jelzi, hogy a próba több azonos szekvenciához hibridizálódott. A hibridizációs körülmények változása (a hibridizáció hőmérsékletének növelése, a sókoncentráció megváltoztatása) a specifitás növekedéséhez és a hasonló, de nem azonos szekvenciákkal való hibridizáció csökkenéséhez vezet.

Jegyzetek

  1. ↑ Hare R. G. , Butvilovsky V. E. , Davydov V. V. , Rachkovskaya I. V .. 7.2.2 DNS-fragmensek elemzése  // Orvosbiológia és általános genetika: tankönyv. — 2. kiadás, javítva. - Minszk: Felsőiskola, 2012. - S. 100. - 496 p. - ISBN 978-985-06-2182-5 .
  2. ↑ 1 2 Arefiev V. A. , Lisovenko L. A. . Southern-blot, Southern-transfer  // Genetikai kifejezések angol-orosz magyarázó szótára / tudományos. szerk. L. I. Patrusev. - M. , 1995. - ISBN 5-85382-132-6 .
  3. ↑ 1 2 3 blot of Suzern  // Orvosi kifejezések nagy enciklopédikus szótára / szerk. prof. E. G. Ulumbekova . - M.  : GEOTAR-Media, 2012. - S. 220. - 2263 p. - 2000 példány.  — ISBN 978-5-9704-2010-2 .
  4. ↑ Blot: western, northern and southern blot (blot, western, northern, southern) // Epidemiological Dictionary / ed. JM Last a Nemzetközi Epidemiológiai Szövetség számára; ill. szerk. orosz szerk. V. V. Vlaszov . - 4. kiadás - M.  : OIZ, 2009. - S. 28, 272. - 316 p.
  5. ↑ Southern, E. M. Specifikus szekvenciák kimutatása gélelektroforézissel elválasztott DNS-fragmensek között // J Mol Biol.. - 1975. - doi : 10.1016 /S0022-2836(75)80083-0

Lásd még