A restrikciós-módosító rendszer baktériumok enzimatikus rendszere , amely elpusztítja a sejtbe bejutott idegen DNS -t . Fő feladata, hogy megvédje a sejtet az idegen genetikai anyagoktól, például bakteriofágoktól és plazmidoktól . A rendszer összetevőit kétféle aktivitás jellemzi - a metiltranszferáz (metiláz) és az endonukleáz . Mindegyik fehérje és egy fehérje, amely mindkét funkciót egyesíti , felelős lehet mindegyikért . [egy]
A restrikciós-módosító rendszer (SR-M) a DNS bizonyos nukleotidszekvenciáira specifikus, amelyeket restrikciós helyeknek neveznek . Ha a szekvenciában bizonyos nukleotidok nem metiláltak , a restrikciós endonukleáz kettős szálú törést vezet be a DNS-be (gyakran több nukleotid eltolódásával a szálak között), miközben a DNS-molekula biológiai szerepe megsérül. Abban az esetben, ha csak az egyik DNS-szál metilálódik, nem történik hasítás, hanem a metiltranszferáz metilcsoportokat ad a második szál nukleotidjaihoz. Az SR-M ezen specifitása lehetővé teszi a baktériumok számára, hogy szelektíven hasítsák az idegen DNS-t anélkül, hogy a sajátjukat befolyásolnák. Normális esetben a baktériumsejtben lévő összes DNS vagy teljesen metilált, vagy csak egy szál mentén (közvetlenül a replikáció után ) teljesen metilált. Ezzel szemben az idegen DNS nem metilálódik, és hidrolízisen megy keresztül. [egy]
A restrikciós-módosító rendszereket a host-controlled restrikciónak nevezett jelenség molekuláris mechanizmusainak tanulmányozása eredményeként fedezték fel . A jelenség lényege abban rejlik, hogy az egyik baktériumtörzs sejtjéből izolált bakteriofágok nagyon rosszul szaporodnak a másikban. A második törzsből izolált vírusrészecskékkel fertőzve az első sejtjei ismét a fágszaporodás visszaszorítását tapasztalják, míg a második törzsben normálisan szaporodnak. Így a baktériumokban a bakteriofágok szaporodását elnyomó rendszer figyelhető meg. Azok a vírusok, amelyeknek mégis sikerült legyőzniük, ellenállnak ennek a rendszernek. S. Luria és ML Human 1952 -es cikkükben [2] ezt írta:
Egyes fágok és gazdabaktériumaik bizonyos mutánsai közötti kapcsolatot elemezve új jelenséggel találkoztunk: a vírus replikációja során a gazdaszervezet genotípusa befolyásolja az új vírusok fenotípusát . A fenotípusos változások gátolják a vírus replikációs képességét bizonyos törzsekben. Ez egy nem állandó változás, egy megfelelő gazdaszervezetben történő sikeres szaporodási ciklus visszaadja a vírust az eredeti formájába.
Eredeti szöveg (angol)[ showelrejt] Egyes fágok és bakteriális gazdáik bizonyos mutánsai közötti kapcsolat elemzése során új helyzettel találkoztunk: a vírus szaporodó gazdaszervezet genotípusa befolyásolja az új vírus fenotípusát. A fenotípusos változás bizonyos gazdaszervezetekben elnyomja a vírus szaporodási képességét, míg másokban nem. Átmeneti változásról van szó, abban az értelemben, hogy egy megfelelő gazdaszervezetben a növekedés egy ciklusa visszaadja a vírust az eredeti formájába.Ezt követően kimutatták, hogy a különböző törzsekből izolált bakteriofágok genotípusa azonos, de a DNS-metiláció eltérő mintázatú, ami megfelel a törzs CP-M specifitásának. [3]
1978-ban Werner Arber , Daniel Nathans és Hamilton Smith fiziológiai és orvosi Nobel-díjat kapott " a restrikciós enzimek felfedezéséért és a molekuláris genetikában való alkalmazásukért".
A CP-M enzimeket Smith és Nathans 1973-ban javasolt rendszere szerint nevezték el . [4] Az enzim neve hárombetűs betűszóval kezdődik , amelyben az első betű megegyezik a nemzetség nevének első betűjével, a többi pedig annak a fajnak az első két betűje , amelyben az enzim megtalálható. . A betűszót dőlt betűvel írják. További betűk egy adott törzs vagy szerotípus megjelölésére szolgálnak . A római számokat abban a sorrendben adjuk meg, ahogyan az adott típusú enzimek megtalálhatók egy adott szervezetben. A további betűk és számok nincsenek dőlt betűvel szedve. Például:
A nyomtatott forrásokban jelentős eltérések mutatkoznak ugyanazon enzimek nevének írásmódjában (a dőlt betűk és a szóközök megléte tekintetében). 2003-ban tudósok nagy csoportja javasolta a restrisztázok és metiltranszferázok osztályozásának és nómenklatúrájának rendszerezését. [5] Különösen javasolt a dőlt betű használatának elhagyása, a teljes név szóközök nélkül írandó. Javasoljuk, hogy kerüljük a „restrikciós enzim” és „metiláz” elnevezéseket, helyettük „restrikciós endonukleázt” és „metiltranszferázt” használjunk; az enzimaktivitás típusát az R (endonukleáz) és M (metiltranszferáz) betűk jelzik az M.EcoRI és R.EcoRI mozaikszó előtt.
A restrikciós endonukleázok mindkét DNS-szálban törést okoznak, és két részre osztják azt. A DNS-vágás sajátosságaitól függően olyan termékek keletkeznek, amelyek végszerkezete eltérő (lásd az ábrát).
A restrikciós-módosító metiltranszferázok metilcsoportokat adnak a DNS-nukleotid-maradékok nitrogéntartalmú bázisaihoz. A metilezés az adenin N5 és N6, a citozin N4 és C5 pozícióiban mehet végbe . A DNS-metiltranszferázok metilcsoportjainak egyetlen donora az S-adenozin-L-metionin . A legtöbb esetben a félig metilált DNS-nek csak a második szála metilálódik, míg a teljesen metilálatlan DNS hasad a CP-M endonukleáz aktivitása miatt.
Minden CP-M kofaktorként Mg 2+ -t igényel. Az első és harmadik típusú SR-M- nek ATP -re van szüksége, a negyediknek pedig GTP -ben . Az S-adenozil-metionin nemcsak metilcsoportok donoraként, hanem alloszterikus szabályozóként is szolgálhat.
Jelenleg az alegység szerkezete, a szubsztrátspecifitás, az enzim kofaktorigénye és a DNS hasítás jellege alapján [1] négyféle restrikciós-módosító rendszert különböztetnek meg. [5] [6]
Az első típusú CRM-eket öt alegység alkotja, amelyek egészként működnek. Az alegységeket a Hsd rövidítéssel (host specificity determinant) és a funkciónak megfelelő betűvel jelöljük (M - DNS metiltranszferáz , R - restrikciós endonukleáz , S - szubsztrát felismerés ). Az első típusú CP-M két HsdM, két HsdR és egy HsdS komplexe. A HsdR felhasítja a foszfodiészter kötéseket a DNS-ben, és helikáz aktivitással rendelkezik. A HsdM a hatodik nitrogénatom (m6A) restrikciós helyein adenin -maradékok metilációját állítja elő. A HsdS bizonyos DNS-régiók felismerését biztosítja, meghatározva az SR-M specificitását. [7]
A nem metilált DNS-re hatva a nukleáz aktivitás dominál, a de novo metiláció rendkívül alacsony hatékonysággal hajtható végre, ami lehetővé teszi a bakteriofágok számára, hogy leküzdjék a CP-M hatását, és képesek legyenek egy új törzsben szaporodni (további részleteket lásd fent ).
A restrikciós hely aszimmetrikus, kétrészes szekvencia: a 3-5 specifikus nukleotidból álló 5'-szekvenciát 6-8 tetszőleges típusú nukleotid választja el a 4-5 bázispárból álló 3'-specifikus szekvenciától. A cél felismerése után az enzimkomplex a DNS-molekula mentén mozog, letekerve azt ( helikáz aktivitás), amíg akadályba nem ütközik (például egy másik fehérjével). Így a restrikciós helytől nagy tetszőleges távolságban (több ezer bázispár) egy törést vezetünk be. [7] A CP-M I-es típusú DNS hasításához ATP hidrolízisre van szükség . Ez annak a ténynek köszönhető, hogy energiára van szükség a DNS-molekula mentén történő mozgáshoz és a CP-M hely felismerése utáni letekercseléséhez. Az ATP-t az ún. A DEAD motor [7] egy konzervált kétdoménes szerkezet, amely a helikázokra és néhány más fehérjére (például a Sec transzlokáz SecA molekuláris motorjára) jellemző. [nyolc]
Ez a típus négy családra (IA-D) oszlik a genetikai komplementáció, a DNS-hibridizáció és az immun-keresztreaktivitás ( antitestekkel való keresztreaktivitás ) alapján. [9]
Az ilyen típusú restrikciós-módosító rendszerekben a metiltranszferáz és nukleáz aktivitást a legtöbb esetben független fehérjék biztosítják. Az endonukleázok a DNS-t szigorúan meghatározott helyeken hasítják a restrikciós helyen belül vagy annak közelében, ennek eredményeként a törési helyen lévő DNS-végeken 3'-hidroxil- és 5'-foszfátcsoportok vannak. Ezen jellemzők miatt az ilyen típusú endonukleázokat (különösen az IIP-t) széles körben használják a géntechnológiában . Az SR-M II működéséhez nincs szükség ATP-re vagy más energiaforrásokra. Az aktív nukleázok monomerként , homodimerként vagy homotetramerként létezhetnek (különböző rendszerek esetén). [5]
A metiltranszferázok általában monomerként működnek. A metilezés a citozin maradék negyedik (N) vagy ötödik (C) pozíciójában , vagy a hatodik (N) - adenin pozícióban történik (különböző rendszerek esetén minden egyes enzim szigorú specificitású). [5]
A II-es típusú SR-M-nek több alcsoportja van, egyes rendszerek egyszerre többhez is tartozhatnak. [5]
Egy felismert palindrom hossza a legtöbb esetben 4, 6 vagy 8 nukleotid. A hasítás a restrikciós helyen belül vagy közvetlenül szomszédos rögzített helyzetben történik. Ugyanakkor a különböző enzimek mind ragadós, mind tompa végek kialakulását okozzák.
A III-as típusú SR-M-ek két alegységet (Res és Mod) tartalmaznak, amelyek endonukleáz és metiltranszferáz aktivitással rendelkező heterotetramerré (Res 2 Mod 2 ) [7] egyesülnek. A Res alegység helikáz aktivitással rendelkezik, és működéséhez ATP hidrolízisre van szüksége . [6] Az 1-es típusú CP-M-mel ellentétben a DNS-hidrolízishez két enzimkomplex kölcsönhatása szükséges. Két azonos restrikciós helyet ismernek fel ellentétes irányban. A helyek lehetnek metilálatlanok vagy egyszálú metiláltak. [7]
A Mod alegység a Res-től külön is működhet, metiltranszferázként (m6A) működik. Ugyanakkor a Res alegység nukleáz aktivitása csak akkor nyilvánul meg, ha komplexben van a Mod-dal. [5]
A IV-es típusú SR-M-ek csak metilált, hidroximetilezett vagy glikozil-hidroximetilezett bázisokat tartalmazó módosított DNS-t hasítanak. A DNS hasítása a GTP hidrolízisét igényli . Az endonukleáz aktivitást egyetlen polipeptid biztosítja. A metiltranszferáz aktivitás hiányzik [10] . A nukleázaktivitást az S-adenozil-metionin alloszterikusan aktiválja . A restrikciós hely aszimmetrikus és két különálló részből áll. A DNS-vágás az egyik hely közelében történik. [6] [7]