A bioortogonális reakciók olyan kémiai reakciók , amelyek az élő rendszerekben a természetes biokémiai folyamatok megzavarása nélkül mehet végbe [1] [2] [3] . A bioortogonális reakciókban részt vevő funkcionális csoportok általában nem találhatók meg a biomolekulákban, gyorsan és szelektíven reagálnak egymással élő sejtkörülmények között , és közömbösek a szervezetben jelen lévő egyéb vegyületekkel szemben. A kifejezést Caroline Bertozzi javasolta 2003-ban [4] . A reakciók elnevezése az „ ortogonális ” szó átvitt jelentésén alapul , vagyis mindentől független , és a mesterséges és természetes folyamatok egymásrafolyásának kölcsönös függetlenségét jelöli.
Annak ellenére, hogy a szerves kémia területén nagyszámú kémiai reakciót fedeztek fel, tanulmányoztak és leírtak, gyakorlatilag egyik sem hajtható végre sejtben vagy szervezetben úgy, hogy csak a kutatót érdeklő vegyületet érintse. fehérje , DNS , metabolit stb.). Ez azért van így, mert a biomolekulák nagyszámú, nagyon hasonló reakcióképességű (főleg nukleofil ) funkciós csoportot tartalmaznak, és az a reakció, amelybe a vizsgált vegyület belép, elkerülhetetlenül hatással lesz más, hasonló funkciós csoportokat tartalmazó molekulákra is, amelyek nemcsak hogy nem felelnek meg a vizsgálat céljainak. tanulmányozását, hanem megzavarják a sejt természetes munkáját, lehetetlenné téve tanulmányozását [5] . A sejten belüli kémiai reakciók lebonyolítása ugyanakkor hasznos kutatási eszköz, mivel lehetővé teszi a vizsgált biomolekulák fluoreszcens , affinitási és tömegspektrometriás jelöléssel történő jelölését , amely lehetővé teszi ezeknek a biomolekuláknak a későbbi megfelelő kutatási módszerekkel történő megfigyelését. például fluoreszcens mikroszkóp segítségével . A bioortogonális reakciók ezt a hiányt hivatottak pótolni, mivel teljesen idegenek a sejttől, mesterségesen bevitt funkciós csoportok között fordulnak elő, és csekély hatással vannak a sejt működésére [3] .
A bioortogonális reakció gyakorlati alkalmazása általában két lépésben történik. Először is, a vizsgált vegyület egy bioortogonális funkciós csoporttal módosul a sejten belül. Ezután egy komplementer funkciós csoportot tartalmazó kis molekulatömegű jelölést vezetnek be a rendszerbe, és egy bioortogonális reakció eredményeként ennek a vegyületnek a szelektív módosulása (jelölése) történik [3] [5] . Ezt követően a bevezetett címke lehetővé teszi a módosított hordozó nyomon követését.
A bioortogonális reakciók mára lehetővé tették különböző biomolekulák , például glikánok , fehérjék [6] és lipidek [7] valós időben történő tanulmányozását élő rendszerekben, citotoxicitás hiányában . Számos kémiai reakciót fejlesztettek ki, amelyek megfelelnek a bioortogonalitás követelményeinek, köztük azidok ciklooktinokhoz való 1,3-dipoláris cikloaddíciója (más néven rézmentes kattintási reakció ) [8] , nitronok ciklooktinokhoz [9 ] ] , oximok vagy hidrazonok képződése karbonilvegyületekből [10] , tetrazinok reakciója ciklookténekkel [11] , izonitrilek kattintási reakciója és kvadriciklán ligálás [13] .
A sejtkörülmények között kémiai reakciót alkalmazó szelektív kovalens módosítás első megfigyelése R. Qian és munkatársai munkájában jelent meg, akik két arzin funkciós csoporttal rendelkező fluoreszceint használtak egy fehérje szelektív módosítására, amelybe egy tetracisztein fragmens került, ami gyakorlatilag hiányzik az emlős fehérjékben , korábban bevezették [14] . Ez a megközelítés lehetővé tette egy kis fluoreszcens jelölés bejuttatását a fehérjébe, míg az akkori standard módszer a zöld fluoreszcens fehérjével vagy annak analógjaival [15] készült hibridek előállítása volt , amelyek sokkal nagyobbak, és ennek következtében néha zavarják a fehérjét. a vizsgált fehérje normális működését.
Ez a megközelítés arra késztette a kémikusokat, hogy olyan kémiai reakciókat és funkcionális csoportokat keressenek, amelyek teljesen idegenek a természetes vegyületektől, a biológusokat pedig arra, hogy találjanak ki módszereket bioortogonális funkciók biomolekulákba való bejuttatására. Az első lépés annak felismerése volt, hogy a biomolekulák főként nukleofil csoportokat tartalmaznak, míg az elektrofil csoportok sokkal ritkábban fordulnak elő bennük. Például a ketonok és az aldehidek nem fordulnak elő a fehérjékben, ugyanakkor reaktivitást mutatnak a hidrazid- és hidroxiamin-csoportokkal szemben, amelyek szintén nem fordulnak elő a biomolekulákban. Ennek köszönhetően az 1990-es évek végén lehetővé vált a glikánok és fehérjék módosítása metabolikusan bevitt ketontartalmú cukrok és aminosavak révén a sejten belül. A kis molekulatömegű metabolitokban (cukrok, piruvát , piridoxál-foszfát stb.) azonban ketonok és aldehidek voltak jelen, vagyis nem voltak teljesen bioortogonálisak [16] .
Ezt követően a vegyészek teljesen természetellenes funkciós csoportok között fellépő bioortogonális reakciókat kerestek. A Staudinger-reakció volt az első kémiai reakció, amelyet a sejten belüli módosítások végrehajtására alkalmaztak. Az ebbe a reakcióba belépő azidcsoport a lágy elektrofilekhez tartozik, amelyek nem képesek reagálni a természetben leggyakrabban előforduló kemény nukleofilekkel. Az azid partnere a foszfin volt, egy lágy nukleofil, amelyet G. Staudinger javasolt 1919-ben [17] . 2000-ben a Staudinger-reakciót C. Bertozzi módosította, és bioortogonális Staudinger -ligálásként alkalmazta biomolekulák széles körének jelölésére élő sejtekben és egész szervezetekben egyaránt [18] .
Ezzel egy időben kezdett kialakulni a kattintáskémia – egy kémiai koncepció, amely szerves vegyületek könyvtárainak előállítását írja le gyors és megbízható reakciók segítségével, amelyek lehetővé teszik molekulák összeállítását kis építőelemekből [19] . Számos reakció közül, amelyek megfelelnek ennek az elképzelésnek, a rézkatalizált azid-alkin cikloaddíció találta a legszélesebb körű alkalmazást biomolekulák in vitro módosítására [20] . A rézkatalizátor toxicitása miatt azonban egy ilyen reakciót nem lehetett alkalmazni élő sejtekben vagy szervezetekben. C. Bertozzi csoportja létrehozta ennek a reakciónak egy nem katalitikus változatát, amelyet stressz-könnyített azid-alkin cikloaddíciónak (SPAAC) neveznek, amely ígéretes bioortogonális reakció [8] .
Jelenleg is folyik az új bioortogonális reakciók keresése annak érdekében, hogy ugyanabban a biológiai rendszerben párhuzamosan lehessen szubsztrátokat módosítani.
Ideális esetben a bioortogonális reakciónak a következő speciális feltételeknek kell megfelelnie [3] [4] :
Ezt a reakciót C. Bertozzi csoportja dolgozta ki 2000-ben az azidok és triarilfoszfinok közötti klasszikus Staudinger-reakció alapján [18] . Ez a reakció a bioortogonális kémia területének ősévé vált, mivel a benne reakcióba lépő csoportok (azidok, foszfinok) nincsenek jelen a biomolekulákban, de ma már nem alkalmazzák olyan széles körben. Staudinger ligálást alkalmaztak biomolekulák módosítására élő sejtekben és egerekben is [4] .
A Staudinger-reakcióban az azidcsoport lágy elektrofilként működik , lágy nukleofilekkel , például foszfinokkal reagálva . Ezzel szemben a legtöbb biológiai nukleofil merev nukleofil, amely nem reagál azidokkal. Ezenkívül a Staudinger-ligálás vizes közegben megy végbe, és stabil termék keletkezik [18] .
A foszfinok hiányoznak a természetes biomolekulákból [21] , és nem állítják helyre a diszulfidkötéseket .
A gyógyszerek ( azidotimidin ) példájával az azidokról kimutatták, hogy biokompatibilisek . Az azidcsoport kis mérete megkönnyíti a biomolekulákba való bejuttatását metabolikus útvonalakon [8] .
A Staudinger-reakció alapja a foszfin nukleofil támadása az azidcsoport terminális nitrogénatomján, és így foszfazid 1 keletkezik . Ezután az 1 -es foszfazid iminofoszforánná 3 alakul, nitrogén felszabadulás kíséretében, majd az iminofoszforán hidrolízise amin és foszfin-oxid képződésével történik. A biokonjugáció területén a reakciót úgy módosították, hogy a foszfin egyik aril-szubsztituensének orto -helyzetébe észtercsoportot vittek be . A keletkező iminofoszforán 3 ezen csoporton való támadásának eredményeként egy biciklusos 4 termék képződik , melynek hidrolízise stabil amidkötés képződéséhez vezet a szubsztrát és a bevitt címke között. A reakció sebességkorlátozó lépése az azidcsoport foszfinmolekula általi megtámadása [22] .
Ennek a reakciónak a fő hátránya, hogy a foszfinokat az oxigén lassan oxidálja az élő rendszerekben. Ezenkívül valószínűleg a citokróm P450 metabolizálja őket [4] . A Staudinger szerinti ligálás a másodrendű kinetika szerint meglehetősen lassan megy végbe, körülbelül 0,0020 M −1 s −1 sebességi állandóval [4] . A nukleofil támadás felgyorsítására irányuló kísérletek elektrondonor csoportok arilszubsztituensekbe való bejuttatásával felgyorsítják a reakciót, de a foszfin oxidáció sebessége is megnő.
A lassú reakciósebesség megkívánja a felhasznált foszfin koncentrációjának növelését, ami növeli a többletcímke által keltett háttérjelet. Ennek a problémának a leküzdésére törekedtek: fluoreszcein [23] és kumarin [24] alapú fluorogén foszfinokat állítottak elő , amelyek hatása azon alapul, hogy a fluoreszcencia csak a biomolekulába való beépülést követően alakul ki, ami lehetővé tette egy nagyobb ugrás a sugárzás intenzitásában a reakció eredményeként. Jelenleg a reakció kinetikája továbbra is komoly akadálya annak széles körű elterjedésének.
A rézmentes azid-alkin cikloaddíció egy bioortogonális reakció, amelyet C. Bertozzi fejlesztett ki a Huisgen-reakció aktivált változataként . A rézkatalizált azid-alkin cikloaddíciótól ( CuAAC , Cu-katalizált azid-alkin cikloaddíció) ellentétben a reakció ezen változata nagyobb sebességgel megy végbe, mivel az addíciós termék képződése során megszűnik a ciklooktin molekulában a szögfeszültség. Ezért ezt a reakciót törzs által előidézett azid-alkin cikloaddíciónak ( SPAC ) nevezték el. Ez a módosítás lehetővé teszi a mérgező rézkatalizátor használatának elkerülését és a rézmentes reakció alkalmazását élő sejtekben és szervezetekben.
A klasszikus rézkatalizált azid-alkin cikloaddíció nagyon gyors és hatékony biokonjugációs reakció, azonban élő sejtekben a Cu + -ionok toxicitása miatt nem alkalmazható . A toxicitás a rézkatalizátorok által generált reaktív oxigénfajták képződésének tulajdonítható .
A ligandumokat úgy optimalizálták , hogy megakadályozzák a biomolekulákat érő káros hatásokat, azonban kimutatták, hogy a komplexekben lévő különböző ligandumkörnyezetek is befolyásolják az anyagcserét, mivel nemkívánatos változásokat vezetnek be a sejtfolyamatokban [25] .
Az azidcsoport bioortogonális, mivel meglehetősen kicsi (a molekula sejtbe való behatolását csekély mértékben befolyásolja), metabolikusan stabil, a natív biomolekulákban nem fordul elő. Bár az azidok nem a legreaktívabb vegyületek az 1,3-dipoláris addícióban, előnyösebbek, mivel a módosítási körülmények között nem lépnek fel mellékreakciók [26] . A ciklooktin fragmens nagyobb, de megvan az in vivo módosításhoz szükséges ortogonalitása és stabilitása . A ciklooktinek a legkisebb stabil ciklikus alkinek . Ciklusukban a számított szögfeszültség 19,9 kcal/mol [27] .
A reakció standard 1,3-dipoláris cikloaddícióként megy végbe, párosított periciklusos elektroneltolódással. Az 1,3-dipólus ambivalens jellege lehetetlenné teszi az azidban lévő elektrofil és nukleofil centrum meghatározását, így az elektronátmeneti irány képe értelmetlen. A számítások azonban azt mutatják, hogy a belső nitrogénatom hordozza a legnagyobb negatív töltést [28] .
A rézmentes azid-alkin cikloaddíciót úgy alakították ki, hogy azidok helyett nitronokat használjon . Ebben az esetben reakciótermékként N - szubsztituált izoxazolinok képződnek . A reakciósebesség vizes közegben növekszik, és a nitronban lévő szubsztituensektől függően 12-32 M - 1 s - 1 konstans másodrendű kinetikának engedelmeskedik . A reakció nagy sebessége ellenére hátránya, hogy a nitront nehéz metabolikus jelöléssel bevinni a biomolekulába. A reakciót modellpeptid módosításra és fehérje pegilációra használták [9] .
2009-ben nitril-oxidok dipoláris cikloaddíciós reakcióját fejlesztették ki norbornénnel . Különösen az oligonukleotidok posztszintetikus módosítására alkalmazták . A norbornént választották dipolarofilnek a stressz által előidézett reaktivitás és stabilitás közötti egyensúly miatt. Ennek a reakciónak a hátránya a nitril-oxid magas elektrofilitása, ami mellékreakciókhoz vezet, valamint az alacsony reakciósebesség [29] .
Az oxanorbornadién és azidok cikloaddíciós reakciója a furán retro-Diels-Alder reakcióval történő eliminációjával megy végbe. Az oxanorbornadién gyűrűs alakja és elektronkimerülése növeli reaktivitását a cikloaddíció korlátozó lépésében. A furán hasítása gyorsan megy végbe stabil 1,2,3- triazol képződésével [30] . Előzetes vizsgálatok kimutatták ennek a reakciónak a hasznosságát peptidek módosításában, és a SPECT -ben képalkotó vegyületek létrehozásában is alkalmazták [31] .
Az s - tetrazinok és ( E )-ciklooktének cikloaddíciója Diels-Alder reakcióként megy végbe , majd egy retro-Diels-Alder reakció következik nitrogén felszabadulásával. A reakció nagyon gyorsan lezajlik, 2000 M – 1 s – 1 ( metanol – víz rendszerben 9:1) másodrendű sebességi állandóval , ami lehetővé teszi a biomolekulák nagyon alacsony koncentrációban történő módosítását.
A számítás kimutatta, hogy a ( Z )-ciklookténekben a stresszenergia 7,0 kcal/mol, ami kevesebb, mint a ciklooktánban (12,4 kcal/mol), két gyűrűn átívelő kölcsönhatás elvesztése miatt. Ellenkezőleg, a kettős kötés ( E )-konfigurációja nagymértékben növeli a gyűrűfeszültséget (17,9 kcal/mol), ami pozitívan befolyásolja a reakciósebességet [32] . Dienofilként 3,6-diaril- s - tetrazint használnak, amely szubsztituenseket tartalmaz a vízzel való kölcsönhatás visszaszorítására. A második szakaszban felszabaduló nitrogén visszafordíthatatlanná teszi a reakciót [33] .
Azt találták, hogy a víz felgyorsítja a tetrazinok ciklooktének reakcióját. Norbornéneket is használtak dienofilként, de a reakció sokkal lassabban ment végbe (1 M – 1 s – 1 vizes közegben). A tetrazinok ( E )-ciklookténnel való reakcióját használták élő sejtek fluoreszcens jelöléssel [34] és polimerek kombinálására [35] .
Az izonitrilek kattanási reakciója [4+1]-cikloaddíció, majd retro-Diels-Alder reakció N 2 felszabadítására . Emiatt a reakció visszafordíthatatlan. A termék stabil, ha tercier izonitrilt használnak. Primer és szekunder izonitrileknél imin képződik, amely azután gyorsan hidrolizál (a diagramon pirossal látható).
Az izonitril kis mérete, stabilitása, nem toxicitása és a biológiai rendszerektől való távolléte miatt jó bioortogonális csoport. A [4+1]-cikloaddíciós reakció azonban lassan, 10–2 M – 1 s– 1 másodrendű sebességi állandóval megy végbe .
A tetrazol fotoindukált cikloeliminációs reakción mehet keresztül nitrogén felszabadulással. Ebben az esetben egy rövid élettartamú 1,3 - dipól képződik , amely 1,3-dipoláris cikloaddícióba lép az alkénekkel , ami pirazolin adduktokhoz vezet [36] .
A fotoindukció rövid távú fényhatás esetén megy végbe (a hullámhossz a tetrazoltól függ). Az expozíciós időt úgy választják meg, hogy csökkentse a fény által a sejtekben okozott károsodást. A reakció vizes közegben felgyorsul, és egyetlen regioizomert eredményez . Ennek a megközelítésnek az előnyei a reakció térbeli és időbeli szabályozásának lehetőségében rejlenek. A reakció alkalmazását az is leegyszerűsíti, hogy egyszerű biológiai módszerekkel alkének vagy tetrazolok vihetők be a biomolekulákba. Emellett létrehoztak egy fluorogén tetrazolt, amely lehetővé teszi a reakció mértékének időbeni nyomon követését [37] .
A kvadriciklán ligálás során a megfeszített kvadriciklán π-rendszerekkel [2+2+2]-cikloaddícióba lép. A kvadriciklán nem fordul elő natív biomolekulákban, nem lép reakcióba velük (a molekula telítettsége miatt), viszonylag kis méretű és erős feszültségű (≈ 80 kcal/mol). Azonban nagyon stabil szobahőmérsékleten és vízi környezetben fiziológiás pH-n. Képes szelektíven reagálni elektronhiányos π-rendszerekkel, de egyszerű alkénekkel , alkinekkel vagy ciklooktinokkal nem [13] .
Második reagensként a bisz(ditiobenzil)-nikkel(II)-t választották a reaktivitás szűrésének eredményeként. A fotoindukált norbornadién inverzió megelőzése érdekében dietil- ditiokarbamátot adnak a reakcióhoz, amely keláttá alakítja a kapott termékben a nikkelt . A reakció 0,25 M -1 s -1 másodrendű sebességi állandóval megy végbe (vizes közegben).
Ennek a reakciónak, valamint a rézmentes azid-alkin cikloaddíciónak és az oximképződés reakciójának felhasználásával módszert hoztak létre három szubsztrát egyidejű jelölésére anélkül, hogy e három reakciót kölcsönösen megzavarták volna [13] .
Számos bioortogonális reakció, elsősorban a Staudinger ligálás és a rézmentes azid-alkin cikloaddíció, széles körben használatos a biokonjugáció és a kémiai biológia területén .
A sejtes fehérjeszintézis rendszerek, valamint az enzimek nem természetes aminosavakat juttathatnak be a fehérjeszerkezetekbe, összetévesztve azokat a természetesekkel. Különösen azt találták, hogy a baktériumok tápközegében a metionin homopropargilglicinnel ( Hpg ) vagy azidohomoalaninnal ( Aha ) való helyettesítése lehetővé tette ezen szintetikus aminosavak integrálását a sejt által szintetizált fehérjékbe. Az ilyen fehérjék bioortogonális funkciós csoportokat, azidot vagy alkint tartalmaztak, a biotin és a komplementer funkciós csoporttal (foszfin, ciklooktin vagy azid) ellátott fluoreszcens festékek sejtbe juttatása pedig lehetővé tette ezen fehérjék szelektív jelölését és tanulmányozását. Ezenkívül az azidohomoalanint és homopropargilglicint egyidejűleg alkalmazták két különböző típusú fehérje párhuzamos módosítására [38] .
A bioortogonális kémia a fehérjék aktivitásprofiljának meghatározásában is alkalmazást talált fehérjék tanulmányozását, amelyek egy adott ligandumhoz affinitást mutatnak . Ehhez a ligandumot egy bioortogonális funkciós csoporttal jelölik, és bejuttatják a sejtbe. Miután a fehérjék kötődnek a ligandumhoz, a sejt elpusztul , és az összes fehérje összessége bekerül a reakcióba valamilyen komplementer reaktív csoportot tartalmazó jelöléssel. Ebben az esetben a jelölés csak a ligandumba kerül, és csak azon fehérjék megkülönböztetését és izolálását teszi lehetővé, amelyek ehhez a ligandumhoz kapcsolódnak [39] .
A glükánokat genetikailag közvetlenül nem kódolják, és nem rendelkeznek a fehérjék specifikus aktivitásával, ezért a genetikai vagy affinitásjelölési módszerek nem alkalmazhatók rájuk. A glikánok azonban metabolikusan módosíthatók módosított szintetikus szénhidrátokkal ( sziálsav , N -acetil- galaktózamin, N - acetil-glükózamin stb.), amelyek azidcsoportokat tartalmaznak. A beágyazott azidcsoportokat tartalmazó glikánokat biotin reagenssel Staudinger-ligálásba vittük be, és áramlási citometriával vizsgáltuk [18] .