A III-as típusú szekréciós rendszerek ( 3. típusú szekréciós rendszer , rövidítés: T3SS ) , szintén III-as típusú szekréciós rendszer vagy injekciózóma (az úgynevezett molekuláris fecskendő ) – a bakteriális szekréciós rendszerek számos típusának egyike , egy fehérjekomplex (néha úgy tekintik, mint egy organellum ), amely egyes Gram-negatív baktériumokban fordul elő [1] .
A patogén baktériumokban a tűszerű szerkezetet szenzoros szondaként használják az eukarióta organizmusokból származó sejtek jelenlétének kimutatására, és olyan fehérjék felszabadítására , amelyek segítenek a baktériumoknak megfertőzni őket. A szekretált effektor fehérjék közvetlenül a baktériumsejtből az eukarióta sejtbe (gazdasejtbe) jutnak [2] , ahol számos olyan hatásuk van, amelyek elősegítik a kórokozó túlélését és az immunválasz elkerülését .
A III. típusú szekréciós rendszer kifejezést 1993-ban vezették be [3] . Ez a szekréciós rendszer legalább öt másik, a Gram-negatív baktériumokban található szekréciós rendszertől különbözik. Számos állathoz és növényhez kapcsolódó baktérium hasonló T3SS-ekkel rendelkezik. A T3SS adatok hasonlóak az eltérő evolúció eredményeként, és a filogenetikai elemzések alátámasztják azt a modellt, amelyben a Gram-negatív baktériumok a mobil T3SS génkazettát vízszintesen továbbíthatják más fajoknak. A legtöbbet vizsgált T3SS fajok a Shigella ( baciláris vérhas ), Salmonella ( tífusz ), Escherichia coli ( bél mikroflóra , egyes törzsek ételmérgezést okoznak ), Vibrio ( gasztroenteritisz és hasmenés ), Burkholderia ( nedvesség ), Yersinia ( pestis ). , Chlamydia ( chlamydia , STD -k ), Pseudomonas (embereket, állatokat és növényeket érint) és az Erwinia , Ralstonia és Xanthomonas növényi kórokozók , valamint a Rhizobium növényi szimbionta .
A T3SS körülbelül 30 különböző fehérjéből áll, így az egyik legösszetettebb szekréciós rendszer. Felépítése hasonló a bakteriális flagellákhoz (hosszú, merev, sejten kívüli struktúrák, amelyeket a mozgékonyságra használnak). A T3SS-ben részt vevő egyes fehérjék aminosavszekvenciája homológ a flagelláris fehérjékkel. Egyes baktériumok, amelyekben T3SS van, szintén rendelkeznek flagellákkal és mozgékonyak (például a Salmonella ), míg másoknak nem (például a Shigella ). Technikailag a III-as típusú szekréciós rendszert mind a fertőzéssel összefüggő fehérjék, mind a flagelláris komponensek tisztítására használják. A "III. típusú szekréciós rendszer" kifejezést azonban főként a fertőző berendezéssel kapcsolatban használják. A bakteriális flagellumnak közös őse van ezzel a szekréciós rendszerrel [4] [5] .
A T3SS elengedhetetlen számos patogén baktérium patogenitásához (fertőzőképességéhez). A T3SS hibái az ilyen baktériumokat nem patogénné tehetik. Felmerült, hogy egyes Gram-negatív baktériumok nem invazív törzsei elvesztették a T3SS-t, mert nem használtak ilyen energetikailag hátrányos (drága) rendszert [6] . Míg a hagyományos antibiotikumok korábban hatékonyak voltak ezekkel a baktériumokkal szemben, folyamatosan új, antibiotikum-rezisztens törzsek jelennek meg. A T3SS működésének megértése és a kifejezetten ehhez a rendszerhez való gyógyszerek kifejlesztése az 1990-es évek vége óta számos kutatócsoport fontos célja volt világszerte.
| III típusú szekréciós rendszer | |
|---|---|
| Needle Complex T3SS | |
| Azonosítók | |
| Szimbólum | T3SS |
| TCDB | 1.B.22 |
| OPM szupercsalád | 348 |
| OPM fehérje | 5tcq |
A T3SS megkülönböztető jellemzője az úgynevezett needle [7] [8] (általánosabb: Needle complex , röv. NC ) vagy a T3SS apparátus ( eng . T3SS apparatus , röv. T3SA ); más néven injektózma , amikor az ATPáz inaktív. ((ki); lásd alább. A kiválasztandó bakteriális fehérjék a bakteriális citoplazmából a tűn keresztül közvetlenül a gazdasejt citoplazmájába jutnak. Három membrán választja el a két citoplazmát: a Gram-negatív kettős membrán (belső és külső membrán) baktériumok és az eukarióta A tű lehetővé teszi a zökkenőmentes átjutást ezeken a rendkívül szelektív és szinte át nem eresztő membránokon. Egy baktériumban több száz tűkomplex lehet elosztva a membránfelületeken. Feltételezték, hogy a tűkomplex az összes T3SS patogén baktérium univerzális tulajdonsága [ 9] .
A tűkomplex eleje a baktérium citoplazmájában található, két membránon áthalad és kinyúlik a sejtből. A membránban található komplex horgonyja a T3SS alapja (vagy alapteste ). Az extracelluláris rész a tű. Az úgynevezett belső rúd köti össze a tűt az alappal. Maga a tű, bár a T3SS legnagyobb és legláthatóbb része, egyetlen fehérje sok egységéből áll. Ezért a különböző T3SS fehérjék többsége az alap részét képezi, és azok, amelyek a gazdasejtbe szekretálódnak. Amint fentebb említettük, a tűkomplex hasonló a bakteriális flagellához . Pontosabban, a tűkomplexum alapja szerkezetileg nagyon hasonló a flagella alapjaihoz; Maga a tű a flagelláris kampóval analóg, az a szerkezet, amely összeköti az alapot a flagelláris filamentummal [10] [11] .
Az alap több körgyűrűből áll, és ez az első szerkezet, amely az új, szög alakú komplexumban épült. Miután az alap felépítése befejeződött, molekuláris gépként szolgál a külső fehérjék kiválasztásához (azaz egy tű). A teljes komplex befejezése után a rendszer átvált olyan fehérjék kiválasztására, amelyeket a gazdasejtekbe kell szállítani. Feltételezzük, hogy a tű alulról felfelé épül; a tű fehérje monomereinek egységeit halmozzuk egymásra, így a tű hegyén lévő egység kerül utoljára. A tű alegység az egyik legkisebb T3SS fehérje, mérete körülbelül 9 kDa. A tű 100-150 alegységből áll.
A T3SS tű körülbelül 60-80 nm hosszú és 8 nm széles a külső részen. A tűnek a lehető legrövidebbnek kell lennie, hogy más extracelluláris bakteriális struktúrák (pl. adhezin és lipopoliszacharid réteg) ne zavarják a szekréciót. A tűlyuk átmérője 3 nm. A feltekeredő effektor fehérjék többsége túl nagy ahhoz, hogy a tű nyílásán keresztül szállítható legyen, ezért a szekretált fehérjék többségének át kell jutnia a fel nem hajtott tűn, ezt a feladatot a szerkezet alján található ATPáz látja el [12] .
A T3SS fehérjék három kategóriába sorolhatók:
A legtöbb T3SS gén operonokban található . Ezek az operonok egyes baktériumfajokban a nukleoidokon , más fajokban pedig izolált plazmidokon helyezkednek el. A szalmonelláknak például van egy kromoszómális régiója, amelyben a T3SS gének többsége összeáll, ez az úgynevezett Salmonella patogenitási sziget ( angolul Salmonella pathogenicity island , röv. SPI ). A Shigella -nak viszont van egy nagy virulens plazmidja, amely tartalmazza az összes T3SS gént. Számos patogenitási sziget és plazmid tartalmaz olyan elemeket, amelyek lehetővé teszik a szigetecske vagy plazmidgén gyakori vízszintes átvitelét egy új fajba.
A tűn keresztül kiválasztandó effektor fehérjéket a rendszernek fel kell ismernie, mivel ezek több ezer más fehérjével együtt lebegnek a citoplazmában. A felismerést egy szekréciós szignál végzi - egy rövid aminosavszekvencia, amely a fehérje elején (N-terminálisán) található (általában az első 20 aminosavat tartalmazza), amelyet a tűkomplex képes felismerni. Más szekréciós rendszerekkel ellentétben a T3SS fehérjék szekréciós jele soha nem hasad le a fehérjéről.
A tű érintkezése a gazdasejttel kiváltja a T3SS aktiválását [13] ; keveset tudunk erről a kiváltó mechanizmusról (lásd alább). A szekréció előidézhető a kalciumionok koncentrációjának csökkentésével a táptalajban ( Yersinia és Pseudomonas esetében ; kelátképző molekulákat , például EDTA -t vagy EGTA-t adnak hozzá), valamint a kongóvörös aromás festék hozzáadásával a táptalajhoz (például Shigella esetében). ). Ezeket és más módszereket laboratóriumokban alkalmazzák a III-as típusú szekréciós rendszer mesterséges stimulálására.
A szekréció indukálása a gazdasejtekkel való érintkezéstől eltérő külső jelek által in vivo is előfordul a fertőzött szervezetekben. A baktériumok érzékelik az olyan jeleket, mint a hőmérséklet , pH , ozmolaritás és oxigénkoncentráció, és ezek alapján „döntsék el”, hogy aktiválják-e a T3SS-t vagy sem. Például a szalmonella jobban képes elszaporodni és bejutni az ileumba , mint az állat vakbélébe . A baktériumok az ezekben a régiókban jelenlévő különféle ionok miatt tudják, hol vannak; az ileum formiát és acetát anionokat tartalmaz, míg a vakbél nem. A baktériumok érzékelik ezeket a molekulákat, megállapítják, hogy az ileumban vannak, és aktiválják szekréciós mechanizmusukat. A vakbélben található molekulák, mint például a propionát és a butirát, negatív hatással vannak a baktériumokra és gátolják a szekréciót. A koleszterin , amely a legtöbb eukarióta sejtmembránban megtalálható, képes szekréciót indukálni a Shigellában.
A fent felsorolt külső jelek közvetlenül vagy genetikai mechanizmuson keresztül szabályozzák a szekréciót. Számos transzkripciós faktor ismert, amelyek szabályozzák a T3SS gének expresszióját. A T3SS effektorokat megkötő chaperonok egy része transzkripciós faktorként is működik. Egy visszacsatolási mechanizmust javasoltak: ha egy baktérium nem szekretál, effektor fehérjéi a chaperonokhoz kötődnek, és lebegnek a citoplazmában. Amikor a szekréció megkezdődik, a chaperonok elkülönülnek az effektoroktól, az utóbbiak pedig kiválasztódnak és elhagyják a sejtet. A magányos chaperonok ezután transzkripciós faktorokként működnek azáltal, hogy az effektoraikat kódoló génekhez kötődve indukálják azok transzkripcióját, és így több effektort termelnek.
A 3SS típusú injekciós sejtekhez hasonló szerkezeteket in vivo javasoltak bakteriális Gram-negatív külső és belső membránok szegecseiként, amelyek elősegítik a külső membrán vezikulák felszabadulását, amelyek célja a bakteriális váladék eukarióta gazdasejtekhez vagy más célsejtekhez való eljuttatása [14] .
A T3SS effektorok bejutnak a tűkomplexumba az alapnál, és a tűn keresztül a gazdasejtbe jutnak. Az effektorok gazdasejtbe való bejutásának pontos módja kevéssé ismert. Korábban azt javasolták, hogy maga a tű képes lyukat szúrni a gazdasejt membránján; ezt az elméletet megcáfolták. Ma már világos, hogy egyes effektorok, az úgynevezett transzlokátorok először kiválasztódnak, és egy pórust vagy csatornát ( transzlokon ) hoznak létre a gazdasejt membránjában, amelyen keresztül más effektorok bejuthatnak. A transzlokátorokban hiányos mutált baktériumok képesek fehérjéket kiválasztani, de nem képesek azokat a gazdasejtekbe eljuttatni. Általában minden T3SS három transzlokátort tartalmaz. Néhány transzlokátor kettős szerepet tölt be; miután részt vesznek a pórusok kialakításában, bejutnak a sejtbe és valódi effektorként működnek.
A T3SS effektorok többféle módon manipulálják a gazdasejteket. A legszembetűnőbb hatás a baktérium gazdasejt általi felvételének stimulálása. Sok T3SS-t hordozó baktériumnak be kell jutnia a gazdasejtekbe, hogy szaporodhasson és szaporodhasson. Az általuk a gazdasejtbe bevitt effektorok arra késztetik a gazdát, hogy elnyelje a baktériumot, és gyakorlatilag „megegye” azt. Ennek érdekében a bakteriális effektorok manipulálják a gazdasejt aktin polimerizációs mechanizmusát. Az aktin a citoszkeleton alkotóeleme , és részt vesz a sejtmozgásban és az alakváltozásokban is. A baktérium T3SS effektorain keresztül képes a gazdasejt saját gépezetét a saját javára használni. Amint egy baktérium bejutott a sejtbe, könnyebben képes más effektorokat kiválasztani, és bejutni a szomszédos sejtekbe, ezáltal gyorsan megfertőzi az egész szövetet.
A T3SS effektorokról kimutatták, hogy befolyásolják a gazdasejt ciklusát , és néhányuk képes apoptózist indukálni . Az egyik legtöbbet tanulmányozott T3SS effektor a Shigella flexneri IpaB . Kettős szerepet tölt be, mind transzlokátorként, pórusokat hozva létre a gazdasejt membránjában, mind effektorként, számos negatív hatást kifejtve a gazdasejtre. Kimutatták, hogy az IpaB apoptózist indukál a makrofágokban , az állati immunrendszer sejtjeiben, miután felvették őket [15] . Később kimutatták, hogy az IpaB ezt a kaszpáz 1 -gyel, az eukarióta sejtek egyik fő szabályozó fehérjével való kölcsönhatása révén éri el [16] .
A T3SS effektorok másik jól jellemzett osztálya a Xanthomonas transzkripciós aktivátorszerű aktivátorai (TAL-effektorok ) . A növényi sejtekbe bejutva ezek a fehérjék bejuthatnak a növényi sejt magjába, promóter szekvenciákat kötve aktiválják a bakteriális fertőzést segítő növényi gének transzkripcióját [17] . A közelmúltban kimutatták, hogy a TAL effektor DNS-felismerés egy egyszerű kódot tartalmaz [18] [19] , amely nagymértékben javította annak megértését, hogy ezek a fehérjék hogyan képesek megváltoztatni a géntranszkripciót a gazdanövényi sejtekben.
A kilencvenes évek közepe óta több száz cikk jelent meg a T3SS-ről. A rendszerrel kapcsolatos számos probléma azonban továbbra is megoldatlan:
Az 1990-es évek eleje óta állandó arányban találtak új T3SS fehérjéket különböző baktériumfajokban. A rövidítéseket egymástól függetlenül adták meg minden egyes szervezet fehérjesorozatára, és a nevek általában nem fedik fel a fehérje számos funkcióját. Később kimutatták, hogy a különböző baktériumokban egymástól függetlenül található fehérjék homológok; történelmi nevek azonban nagyrészt fennmaradtak, ami zavart okozhat. Például a SicA, IpgC és SycD fehérjék a Salmonella , a Shigella és a Yersinia homológjai , de a nevükben szereplő utolsó betű ("sorszám") nem utal erre a jelenségre.
Az alábbiakban összefoglaljuk a leggyakoribb fehérjesorozat-neveket több T3SS-tartalmú fajban. Vegye figyelembe, hogy ezek a nevek magukban foglalják a T3SS mechanizmust alkotó fehérjéket, valamint a szekretált effektor fehérjéket:
Ezeket a rövidítéseket betű vagy szám követi. A betűk általában a "sorszámot" jelölik, vagy a felfedezés kronológiai sorrendjét, vagy azt a fizikai sorrendet, amelyben a gén megjelent az operonban. A számok ritkább esetben a fehérje molekulatömegét jelzik kDa-ban. Példák: IpaA, IpaB, IpaC; MxiH, MxiG, MxiM; Spa9, Spa47.
Számos kulcselem megjelenik az összes T3SS-ben: a tű monomer, a tű belső tengelye, körkörös fehérjék, két transzlokátor, a tűhegy fehérje, egy lineáris fehérje (amelyről úgy gondolják, hogy meghatározza a tű hosszát; lásd fent), és ATPáz, amely energiát szolgáltat a szekrécióhoz. Az alábbi táblázat felsorol néhány kulcsfontosságú fehérjét négy T3SS-tartalmú baktériumban:
| ↓ Funkciók / Nem → | Shigella | Salmonella | Yersinia | Escherichia |
|---|---|---|---|---|
| Tű monomer | MxiH | PrgI | YscF | EscF |
| Belső rúd | MxiI | PrgJ | YscI | EscI |
| Tűhegy fehérje | iPad | SipD | LcrV | Espa |
| Transzlokátor | IpaB | SipB | YopB | EspD |
| Transzlokátor | IpaC | SipC | YopD | EspB |
| Két transzlokátor kísérője | IpgC | SicA | SycD | CesD |
| ATPáz | Spa47 | InvC | YscN | SepB (EscN) |
| Lineáris fehérje | Spa32 | InvJ | YscP | Orf16 |
| Kapcsoló | Spa40 | gyógyfürdők | YscU | Escu |
| Portás | MxiC | InvE | YopN (TyeA) | szept |
A nagy, törékeny, hidrofób membránszerkezetek sejtekből való izolálása évek óta probléma. Az 1990-es évek végére azonban számos megközelítést fejlesztettek ki a T3SS tűszerű komplexek (NC-k) izolálására. 1998-ban izolálták az első NC-ket Salmonella typhimuriumból [27] .
Az izolált baktériumokat nagy térfogatú folyékony tápközegben növesztjük, amíg el nem érik a log fázist. Ezután centrifugálják; a felülúszót (tápközeget) dekantáljuk, és a pelletet (baktériumokat) újraszuszpendáljuk lízispufferben, amely általában lizozimot és néha detergenseket , például LDAO-t vagy Triton X-100-at tartalmaz . Az ilyen puffer tönkreteszi a sejtfalat . Több ciklus lízis és mosás után a kitett baktériumokat ultracentrifugálási sorozatnak vetjük alá . Ez a megközelítés növeli a nagy makromolekuláris struktúrák számát, és eldobja a kis sejtes komponenseket. Ezenkívül a végső lizátumot további tisztításnak vetjük alá CsCl sűrűséggradiens alkalmazásával.
A további tisztítás egy további módszere az affinitáskromatográfia . A fehérjecímkét (pl. hisztidin jelölést) hordozó rekombináns T3SS fehérjéket molekuláris klónozással nyerik, majd bejuttatják (transzformálják) a kérdéses baktériumokba. Az NC kezdeti izolálása után a fent leírtak szerint, a lizátumot egy oszlopon vezetjük át, amely a jelöléshez nagy affinitású részecskékkel van bevonva (hisztidin jelölések esetében: nikkelionok). A jelölt fehérjét az oszlopban tároljuk, és vele együtt a teljes tűkomplexet. Ilyen módszerekkel nagy tisztasági fok érhető el. Ez a tisztaság szükséges sok olyan kényes elemzéshez, amelyet az NC jellemzésére használtak.
A III-as típusú effektorok az 1990-es évek eleje óta ismertek, de az, hogy hogyan jutnak el a gazdasejtekbe, teljes rejtély maradt. A sok flagelláris fehérje és a T3SS fehérje közötti homológia arra késztette a kutatókat, hogy a T3SS külső flagellaszerű szerkezetét gyanítsák. A tű szerkezetének azonosítása és későbbi izolálása lehetővé tette a kutatóknak, hogy:
Mint szinte minden fehérje esetében, a T3SS NC megjelenítése csak elektronmikroszkóppal lehetséges . Az NC első képei (1998) élő baktériumok sejtfalából kiálló tűszerkezeteket és lapos, kétdimenziós izolált NC-ket mutatnak [27] . 2001-ben az NC Shigella flexneri képeit digitálisan elemezték és átlagolták az első félig 3D NC szerkezet létrehozásához [7] . 2003-ban a Shigella flexneriből származó NC spirális szerkezetét 16 angström felbontású röntgenszál-diffrakcióval [28] kapták meg, majd egy évvel később publikálták az NC Salmonella typhimurium 17 angström háromdimenziós szerkezetét [29]. . A legújabb fejlesztések és megközelítések lehetővé tették az NC-k nagy felbontású 3D-s képeinek előállítását [30] [31] , amelyek tovább világítják az NC-k összetett szerkezetét.
Az elmúlt években számos T3SS fehérjét kristályosítottak ki. Ide tartoznak az NC szerkezeti fehérjék, effektorok és chaperonok. A tűkomplex monomer első szerkezete a " Burkholderia pseudomallei" BsaL NMR szerkezete, majd a Shigella flexneri MixH kristályszerkezete volt , amelyeket 2006-ban vizsgáltak [32] [33] .
2012-ben a vad típusú tűkomplexek rekombináns előállításának, a szilárdtest NMR spektroszkópiának, az elektronmikroszkópiának [34] és a Rosetta biopolimerek modellezésének kombinációja feltárta a szupramolekuláris határfelületeket, és végül a Salmonella typhimurium T3SS tű teljes atomi szerkezetét [35]. ] . Kimutatták, hogy a 80 aminosavból álló PrgI alegységek jobb oldali spirális csomót alkotnak, amely körülbelül 11 alegységet tartalmaz a hélix két fordulóján, hasonlóan a Salmonella typhimurium flagellumához . A modell egy kiterjesztett amino-terminális domént is feltárt, amely a tű felszínén található, míg a nagymértékben konzervált karboxi-terminális a lumenbe irányul [35] .
Számos módszert alkalmaztak a T3SS-t alkotó fehérjék tömbjének azonosítására. Az izolált tűkomplexeket gélelektroforézissel (SDS-PAGE) lehet elválasztani . A festés után megjelenő sávok egyenként kivághatók a gélből, és fehérjeszekvenálás és tömegspektrometria segítségével elemezhetők. Az NC szerkezeti komponensei egymástól elválaszthatók (például a tűrész az alaprésztől), és ezeket a frakciókat elemezve meghatározható, hogy mindegyikben milyen fehérjék vesznek részt. Alternatív megoldásként az izolált tűkomplexeket közvetlenül elemezhetjük tömegspektrometriával , előzetes elektroforézis nélkül , hogy teljes képet kapjunk az NC proteomról .
Számos vegyület gátolja a T3SS-t Gram-negatív baktériumokban, beleértve a guadinomint, amelyet a Streptomyces fajok természetesen termelnek [36] .