Egysejtes DNS szekvenálás

Az oldal jelenlegi verzióját még nem ellenőrizték tapasztalt közreműködők, és jelentősen eltérhet a 2019. október 12-én felülvizsgált verziótól ; az ellenőrzések 5 szerkesztést igényelnek .

Az egysejtű DNS-szekvenálás egy olyan  megközelítés, amely lehetővé teszi egy egyedi sejt DNS -szekvenciájáról adatok beszerzését szekvenálás segítségével , és ezáltal az egysejtű szervezetek egyes sejtjei , szervei, szövetei és többsejtű szervezetek sejtalpopulációi közötti különbségek azonosítását . A megközelítés lehetővé teszi a sejt funkcionális jellemzőinek elemzését a mikrokörnyezet összefüggésében. Az egysejt genom szekvenálása több lépésből áll: egyetlen sejt izolálása, teljes genom amplifikációja , könyvtár létrehozása és DNS szekvenálás következő generációs szekvenálási technikákkal .

A különféle szekvenálási módszerek megjelenésével lehetővé vált a genomiális DNS szekvenciájának megállapítása. Az eddigi legtöbb adatot azonban mikroorganizmusok populációiból vagy többsejtű szervezetek sejtalpopulációiból izolált genomiális DNS-minták szekvenálásával szerezték [1] . Ismeretes azonban, hogy mindkét csoporton belüli diverzitás jelentős lehet, mivel maguk a sejtek különböző módon járulnak hozzá egy populáció vagy szervezet létezéséhez.

Egyetlen sejt genomjának szekvenálása lehetővé teszi a genom vizsgálatának sejtszintre történő átvitelét. Manapság olyan problémák megoldásában segít, mint a nem tenyészthető mikroorganizmusok de novo szekvenálása [2] , a genetikai mozaik tanulmányozása normál és patológiás esetekben [3] , a tumorsejt-alpopulációk rákfejlődéshez való hozzájárulásának azonosítása tanulmányozása . kezelésrezisztencia kialakulása [ 4] .

Technológiai kihívások

Az egysejtű DNS-szekvenálás az egyes sejtek fizikai izolálása , a legkevesebb hibalehetőséget biztosító amplifikációs módszer megválasztása, valamint a szekvenálási módszer megválasztása kihívásokkal néz szembe, hogy megfelelő mennyiségű anyagot kapjunk [5] [6] .

Egyedi cellák elkülönítése

A sejtek izolálásának első lépése az életképes sejtek szuszpenziójának létrehozása, amelyek nem kapcsolódnak egymáshoz. Az izolálás célja lehet a sejtek véletlenszerű kiválasztása, hogy reprezentatív mintát hozzunk létre az alpopulációk összetételének elemzésekor, vagy célzott sejtek keresése. A kemény szövetek vizsgálatánál a minta előzetes mechanikai vagy kémiai disszociációja szükséges, és a disszociációs feltételeknek egyformán kell hatniuk a szöveti sejtek minden alpopulációjára. Ez szükséges egy olyan minta létrehozásához, amely elfogulatlan az eredeti sejthalmazhoz képest , ahol a sejtek kezdeti reprezentációja megmarad, ami fontos lehet az alpopulációk összetételének elemzéséhez. Nem szabad megfeledkezni arról, hogy a normál és az egészségtelen szövetek disszociációjának feltételei eltérőek lehetnek, ezért ebben a szakaszban fontos a megfelelő feltételek kiválasztása. Teljes szövetmintákkal is lehet dolgozni, például lézeres rögzítés mikrodisszekcióval [7] .

A szuszpenzió előállítása után a sejteket sorozathígítással [8] , mikropipettázással [9] , mikroüreges hígítással [10] , optikai csipesz segítségével izolálhatjuk . Fluoreszcens áramlási citometria használható specifikus fluoreszcens tulajdonságokkal rendelkező sejtek izolálására, amelyek lehetnek természetesek vagy a kísérletvezető által bevitt sejtek. A mikromanipuláció automatizált módszerei [11] [12] a közelmúltban nagy fejlődésen mentek keresztül, beleértve a sejtek izolálását chipeken mikrofluidikai technológiák [13] segítségével ; a nanobiopsziák vétele már lehetővé teszi az egyes organellumok DNS-ének tanulmányozását [14] . Az izolált sejtek ezt követően lízisen mennek keresztül .

Teljes genom amplifikáció

A következő lépés, a teljes  genom amplifikáció (WGA ) arra szolgál, hogy elegendő DNS-t állítsanak elő a jel detektálásához, és a jövőben a szekvenálás során kivonják a zajból. Ugyanakkor kívánatos minimálisra csökkenteni az olyan műtermékek bejutását, mint az egyszerű szekvenciák preferenciális amplifikációja, véletlenszerű mutációk bevezetése és kiméra szekvenciák kialakulása. A közelmúltban egy sor lehetőség jelent meg ennek a problémának a megoldására. A PCR alkalmazása nem indokolt, például a hőstabil polimerázok által okozott hibák megnövekedett gyakorisága miatt . Ezért az izoterm és hibrid módszerek, mint például az amplifikáció módszere többszörös eltolásos erősítéssel ( English  Multiple Displacement amplification, MDA ) és az amplifikáció többszörös egyenirányítással és hurkolással ( English  Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles, MALBAC ) [15] .

MDA

Az MDA gyors DNS-amplifikációt tesz lehetővé PCR szükségessége nélkül. A módszer a fág polimeráz phi29 alkalmazásán alapul, amelyet fokozott processzivitás (10 kilobázisnál hosszabb régiókat képes disszociáció nélkül szintetizálni ) és alacsony hibaarány ( 1/10 6-10 7 bázispár ) jellemez. A reakció a következőképpen megy végbe: a hexamer primereket a mátrixon összekeverjük, polimerázzal megnyújtjuk; amikor az enzim egy másik primerrel találkozik (amely szintén megnyúlik), kiszorítja (lecseréli), és folytatja útját a templáton keresztül. A helyettesített újonnan szintetizált hely az új primerek leszállóhelyeként szolgál, és sablonná válik. Így létrejön egy elágazó fa, ahol minden ágon megtörténik a szintézis. Az eljárás végén a polimerázt gátolják , az S1 nukleázt hozzáadják az elágazási helyeken elágazó helyek hasításához, és a DNS polimeráz I -et a kapott egyszálú szakaszok teljessé tételéhez [15] .

A módszernek számos problémája van, mint például az allélvesztés , a preferenciális amplifikáció és a primerek közötti kölcsönhatások. Az első probléma abból adódik, hogy a heterozigótákban csak az egyik allél véletlenszerű amplifikációja következik be , ami azt eredményezi, hogy a heterozigótákat helytelenül homozigótaként azonosítják . Ennek a hatásnak a nagy gyakorisága (0 - 60%) miatt a genotipizálás pontossága csökken . A második probléma az egyik allél túlzott erősítése a többihez képest. A hexamer primerek közötti kölcsönhatások a szekvenciák véletlenszerű természete miatt lépnek fel; jelentősen csökkenthetők ezeknek a primereknek a szintézisére vonatkozó korlátozások bevezetésével [15] .

MALBACS

A MALBAC egy hibrid lineáris teljes genom amplifikációs módszer. A módszer speciális primereken alapul: ezek 35 nukleotid hosszúak , ebből 27 azonos minden primerben (GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG), a fennmaradó 8 nukleotid pedig eltérő. A teljes amplifikációs folyamatot a következőképpen írjuk le [9] :

  1. A kétszálú DNS olvadása (94 °C) egyszálú fragmentumok képződésével.
  2. Hűtés (0 °C), primerek és polimeráz hozzáadása.
  3. Alapozók lágyítása a sablon véletlenszerű helyein. A Bst DNS polimeráz megnyújtja a primereket, hogy félamplikont képezzen 64 °C-on. Minden ellenprimer kiszorul a sablonból.
  4. Olvadás (94 °C), a félamplikon elválasztása a mátrixtól.
  5. Hűtés (0 °C), primerek és polimeráz hozzáadása. A primerek hatékonyan kötődnek mind a templáthoz, mind a félamplikonhoz.
  6. A Bst DNS polimeráz 64 °C-on kiterjeszti a primereket. A félamplikonok a kezdeti mátrixon, a teljes amplikonok a korábban kapott félamplikonokon szintetizálódnak .
  7. Olvadáspont (94 °C).
  8. Hurkolás (58°C): A teljes amplikonok 3' és 5' végei komplementerek egymáshoz, és hurkot képeznek, megakadályozva a teljes amplikon sablonként való használatát.
  9. Ismételje meg az 5-8. lépéseket ötször.
  10. PCR 27 általános nukleotidot használva primerként csak a teljes amplikonok amplifikálására [9] .

A módszer előnye, hogy a PCR amplifikáció exponenciális jellegéből adódó zaj csökken az előzetes kvázi-lineáris amplifikáció bevezetése miatt. Ez lehetővé tette a genom lefedettségének növelését (legalább egy leolvasással lefedett genom arányát), az allélok és az egynukleotidos polimorfizmusok (SNP-k) elvesztésének valószínűségének csökkentését. Emellett nagyon kis mennyiségű kezdeti DNS szükséges a bejutáshoz, azonban a minták bármilyen szennyeződése jelentősen befolyásolhatja a szekvenálás eredményeit [9] .

Hátránya, hogy az álpozitív eredményektől való megszabaduláshoz össze kell hasonlítani 2-3 sejt szekvenálásának eredményeit mind az azonos, mind a különböző sejtvonalakból [9] . Ebben az esetben bizonyos polimorfizmusok elveszhetnek, mivel az azonos sejtvonalhoz tartozó sejtek genomjában még vannak eltérések. Ezenkívül az alkalmazott bst DNS polimeráz nagy hibaaránnyal rendelkezik (1:10 5 bázis) [16] .

Teljes genom amplifikációs módszerek összehasonlítása

A közelmúltban több tanulmány is készült ezen módszerek összehasonlításáról [17] [18] [19] . Egy tanulmány arra a következtetésre jutott, hogy az MDA nagyobb lefedettséget biztosít, mint a MALBAC (84%, illetve 52%), ami lehetővé teszi az egynukleotidos polimorfizmusok pontosabb kimutatását [17] . A MALBAC azonban egyenletesebb lefedettséget biztosít, és ezáltal lehetővé teszi a másolatszám-variációk (CNV-k) pontosabb kimutatását [17] . Érdekes módon egyes sejtek szekvenálásakor a kópiaszám-változások MDA-módszerrel történő kimutatásának szintje hasonló volt a MALBAC-éhoz [17] . Más szerzők is megerősítik az MDA és a MALBAC közötti lefedettség különbségét (84% és 72%), valamint a MALBAC lefedettség viszonylag nagyobb egyenletességét ( variációs együttható 0,10 versus 0,21 az MDA esetében) [18] . Az MDA-ról kimutatták, hogy kevesebb téves pozitív eredményt produkál, de a hamis negatívok száma kísérletenként változik [18] . A MALBAC alacsonyabb allélvesztési arányt ad (21%), azonban lefedettsége kisebb, mint az MDA-é [18] . Általában nem világos, hogy melyik vezet kevesebb hamis negatívhoz, mivel az MDA a genom nagyobb részét fedi le, de több allélt veszít a heterozigótában csak az egyik allél preferenciális amplifikációja miatt [15] [18] .

Így az MDA-nak és a MALBAC-nak számos előnye és hátránya van, és a választásnak az adott feladattól kell függnie.

Könyvtár létrehozása

Az amplifikáció után a könyvtárakat kereskedelmi forgalomban kapható kitekkel lehet előállítani . Itt több lehetőség is lehetséges: egy adott lókusz kiválasztása , egy exóm vagy a teljes genom kiválasztása további szekvenáláshoz. Ezen opciók mindegyike feltételezi a fedezet, a hibahajlam és a költség bizonyos értékeit [20] . A kis területek kiválasztása lehetővé teszi, hogy olyan területekre összpontosítson, amelyek biológiailag a legnagyobb mértékben járulnak hozzá a vizsgált rendszer munkájához. Ez csökkenti a kutatás költségeit és annak valószínűségét, hogy a minták előkészítése során hibákat vétenek. A referenciagenom [en] használata csökkenti téves pozitív eredményeket, bár a kimutatott egyetlen nukleotid polimorfizmust a referenciagenomban lévőkre korlátozza. Az exome szekvenálás lehetővé teszi a sejtek egyedi jellemzőinek izolálását, azonban a szekvenált régió hosszának növekedésével megnő annak a valószínűsége, hogy az amplifikáció során hibák lépnek fel. A teljes genom felhasználása lehetővé teszi a nem kódoló és strukturális régiók azonosítását, de a kutatás költségei drámaian megnőnek, ami megnehezíti számos sejt teljes genom szekvenálásának elvégzését [20] .

Az így vagy úgy létrehozott könyvtárakból származó DNS-t a létező módszerek valamelyikével használják a szekvenáláshoz .

Adatfeldolgozás

Gyakori hibák

A legtöbb szekvenálási műtermék a minta előkészítése során fordul elő: sejtizolálás, genomiális DNS-szennyeződés, amplifikáció és könyvtár létrehozása, mivel ezek a lépések mindegyike további hibákat, a lefedettség elvesztését, a lefedettség homogenitásának csökkenését, a mintavételi torzítást bizonyos sejtcsoportok preferenciális szelekciójában és az amplifikációban okozza. bizonyos DNS-szekvenciák az okai a heterozigóta pozíciókban lévő allélok elvesztésének. Figyelembe kell venni azokat a sejtvonalakat is, amelyeken a szekvenálás minden szakaszát optimalizálják: nem minden sejt diploid , vannak haploid és aneuploid populációk is, és ezek ploiditása jelentősen befolyásolhatja a kísérletet [4] . A különböző eredmények összehasonlításának akadálya ezen a területen néha az, hogy nem áll rendelkezésre információ a kiértékelt sejtek teljes számáról és a szekvenálás minőségi értékelésének mértékéről az egyes vizsgálatokban [20] .

Egy nukleotid polimorfizmusok

Az 1000 genom projekt szerint az egynukleotidos polimorfizmusok hozzák a legnagyobb diverzitást az emberi genomban [21] : 38 millió egynukleotidos polimorfizmus, 1,4 millió inszerció / deléció és több mint 14 ezer nagy deléció [21]. megerősítették a haplotípus térképen . Feltételezik továbbá, hogy sok összetett betegség, mint például az Alzheimer-kór [22] , a különböző típusú rák [23] , az autoimmun betegségek [24] pontosan összefüggésbe hozható a polimorfizmusok jelenlétével.

Napjainkban az egysejtű szekvenálási adatok polimorfizmusainak keresése ugyanazokra az algoritmusokra támaszkodik, mint a hagyományos szekvenálási eredmények elemzése: GATK [25] , SNPdetector [26] , SOAPsnp [27] , VarScan [28] . Vannak azonban különbségek a sejtpopuláció szekvenálása és az egysejtes szekvenálás között: az utóbbinak kisebb a genom lefedettsége és magasabb a hamis pozitív arány.

A DNS-szakaszok kópiaszámának változása

A DNS-fragmensek kópiaszámának változásai e fragmentumok abnormális számú kópiához vezetnek; az ilyen típusú genetikai polimorfizmus sokfélesége az emberi egészségre is kihat [29] [30] . Egyes tanulmányok hangsúlyozzák összefüggésüket a daganatok [31] , autoimmun betegségek [24] , autizmus [32] stb. kialakulásával. Itt is, mint az egynukleotidos polimorfizmusok keresésében, alapvetően ugyanazokat az algoritmusokat használják, mint a hagyományos szekvenálásnál: CNV -seq [33] , PenCNV [34] , CNAseg [35] , ReadDepth [36] és cn.MOPS [37] . A bevitt zaj figyelembevételéhez szükséges elemezni az amplifikációs módszerek hatását a DNS kópiaszám-variációk megjelenésére és eltűnésére [38] .

A sejtek összehasonlító elemzése

A genomi adatokon alapuló sejtklaszterezés egyik stratégiája egy távolságfüggvény bevezetése, amely számszerűsíti a mintapárok közötti különbségeket [39] . Ebben az esetben a Jaccard-mérés tekinthető a legmegfelelőbbnek a genetikai adatok bináris jellege miatt (lásd alább) [40] . A távolságfüggvény alapú módszerek alternatívája a modellalapú klaszterezés , amely valószínűségi megközelítést feltételez: a "kemény" távolságok helyett a különböző klónokból származó sejtek "puha" származási valószínűségét vezetik be.

Miután az egysejtű szekvenálás adatait mátrixként mutattuk be , ahol a kérdéses mutációk függőlegesen, a sejtek pedig vízszintesen vannak jelölve, 0-val és 1-gyel töltjük ki, attól függően, hogy egy adott mutáció egy adott sejtben van-e. Ha egy daganatot vizsgálnak, akkor idővel bizonyos klónok kiterjedése, mások eltűnése jellemzi [41] . Ugyanakkor nem tudjuk, hogy mely klónok közül hány van jelen, és feltételezzük, hogy az adatok egy része elveszett a minta-előkészítés során.

A modellparaméterek, mint például a sejt egy adott klónból való leszármazásának valószínűsége, valamint a hamis negatív arány, egy várakozásmaximalizáló algoritmus segítségével becsülhetők [42] . Ezután a klónok számának meghatározásának problémája a szekvenálási adatokat legjobban leíró statisztikai modell kiválasztására redukálódik; az értékelés Bayes és Akaike információs kritériumai alapján történik [43] . Létezik egy hibrid megközelítés is, amely lehetővé teszi a kezdeti klaszterezést távolságfüggvény segítségével, ami növeli a nagy számítási teljesítményt igénylő modellalapú klaszterezés sebességét [44] . A klaszterezés eredményei alapján a konszenzusos klonális mutációk profilja épül fel [45] . Eszerint a fák felépítésének különféle módszerei segítségével azonosítható a különböző klónok közötti kapcsolat. Lehetőség van például egy daganat evolúciós történetének bemutatására [45] .

Eredmények

Mellráksejtek klonális evolúciója

Az emlőráksejtek különböző populációinak mutációs mintáinak (inszerciók, deléciók, egyetlen nukleotid szubsztitúciók, génkópiaszám - variációk ) elemzése lehetővé tette mind az egyes populációkra jellemző mutációk (klonális mutációk), mind azokban előforduló mutációk azonosítását. több sejt (szubklonális mutációk) . Az adatokat egysejtes exome szekvenálással nyertük, mély szekvenálással ellenőrizve. A tanulmány az ERBC (ER + /PR + /Her2 - ) és a TNBC (ER - /PR - /Her2 - ) aneuploid populációinak sejtjeit használta , amelyek különböznek a membránon lévő bizonyos receptorok (ER/PR/Her2) jelenlétében. felszínén, valamint a normál diploid sejtekben. Az eredmény szignifikánsan több klonális mutáció azonosítása volt a TNBC populációban, mint az ERBC és a normál sejtekben. A TNBC sejtpopulációban kimutatták a rákos sejtek három alpopulációjának létezését, amelyeket szubklonális mutációk mintázata alapján azonosítottak. Bizonyítékot kaptak arra vonatkozóan, hogy a TNBC-k mutációs rátája magasabb, felhalmozódásuk nem csak a felgyorsult proliferáció során fellépő hibák miatt következhet be [4] .

Egyelőre nem világos, hogy a daganatok pontosan hogyan válnak rezisztenssé a kemoterápiával szemben . Vagy vannak már ritka rezisztens sejtek a populációban, vagy a válasz spontán a gyógyszerek hatására következik be. Ráadásul nem mindig világos, hogy miért halmozódnak fel a mutációk: vagy felgyorsult mutációs rátáról van szó, mint a TNBC esetében, vagy a mutációk normál ütemű, de a felgyorsult proliferáció miatt nagy számban történő felhalmozódásáról [4]. .

Perspektívák

Jelenleg a fő probléma egy genomiális DNS-amplifikációs lépés jelenléte, amely a legtöbb műtermék bejuttatásáért felelős. A könyvtárak készítésénél egyre csökkennek a DNS mennyiségére vonatkozó követelmények, és az izolált DNS-ből könyvtárak közvetlen létrehozását már bizonyították [46] [47] . Ezenkívül kimutatták, hogy teljesen el lehet hagyni a könyvtárakat, ha egy sejtből izolált DNS-t szekvenálásra bocsátanak [48] . Lehetőség van epigenetikai információk feltárására is, például metilációs minták keresésére [49] [50] és a kromoszómák konformációs állapotának rögzítésére [51] . Manapság a tudósok jellemzően több tíz-száz sejten dolgoznak, de a sejtbefogásra, DNS-amplifikációra és könyvtár-előkészítésre szolgáló automatizált platformok kifejlesztése jelentősen megnöveli az egysejt-elemzés mértékét és elérhetőségét, lehetővé téve nagyobb kísérletek rövidebb időn belüli elvégzését. [52] .

Az egysejtű DNS-szekvenálás alkalmazása, valamint az epigenomikus és transzkriptom vizsgálatokkal lehetővé válik a sejtek pontos osztályozása és a sejtpopulációkról alkotott jelenlegi nézet kiegészítése. Lehetővé válik továbbá a genomszekvencia, az epigenetikai állapot és a génexpresszió közötti összefüggések megállapítása, valamint a sejtek funkcionalitásának meghatározása [52] .

Lásd még

Jegyzetek

  1. ↑ Tringe SG , von Mering C. , Kobayashi A. , Salamov AA , Chen K. , Chang HW , Podar M. , Short JM , Mathur EJ , Detter JC , Bork P. , Hugenholtz P. , Rubin EM Comparative metagenomics of microbial közösségek.  (angol)  // Tudomány (New York, NY). - 2005. - 20. évf. 308. sz. 5721 . - P. 554-557. - doi : 10.1126/tudomány.1107851 . — PMID 15845853 .
  2. ↑ Marcy Y. , Ouverney C. , Bik EM , Lösekann T. , Ivanova N. , Martin HG , Szeto E. , Platt D. , Hugenholtz P. , Relman DA , Quake SR Biológiai "sötét anyag" feldarabolása egysejttel ritka és nem tenyésztett TM7 mikrobák genetikai elemzése az emberi szájból.  (angol)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2007. - Vol. 104. sz. 29 . - P. 11889-11894. - doi : 10.1073/pnas.0704662104 . — PMID 17620602 .
  3. ↑ McConnell MJ , Lindberg MR , Brennand KJ , Piper JC , Voet T. , Cowing-Zitron C. , Shumilina S. , Lasken RS , Vermeesch JR , Hall IM , Gage FH Mosaic copy number variation in human neurons.  (angol)  // Tudomány (New York, NY). - 2013. - Kt. 342. sz. 6158 . - P. 632-637. - doi : 10.1126/tudomány.1243472 . — PMID 24179226 .
  4. ↑ 1 2 3 4 Wang Y. , Waters J. , Leung ML , Unruh A. , Roh W. , Shi X. , Chen K. , Scheet P. , Vattathil S. , Liang H. , Multani A. , Zhang H. . , Zhao R. , Michor F. , Meric-Bernstam F. , Navin NE Klonális evolúció az emlőrákban, amelyet egymagos genom szekvenálással tártak fel.  (angol)  // Természet. - 2014. - Kt. 512, sz. 7513 . - P. 155-160. - doi : 10.1038/nature13600 . — PMID 25079324 .
  5. ↑ Wen L. , Tang F. Egysejtes szekvenálás az őssejtbiológiában.  (angol)  // Genombiológia. - 2016. - Kt. 17. sz. 1 . - P. 71. - doi : 10.1186/s13059-016-0941-0 . — PMID 27083874 .
  6. ↑ Bacher R. , Kendziorski C. Egysejtes RNS-szekvenálási kísérletek tervezése és számítási elemzése.  (angol)  // Genombiológia. - 2016. - Kt. 17. sz. 1 . - P. 63. - doi : 10.1186/s13059-016-0927-y . — PMID 27052890 .
  7. ↑ Emmert-Buck MR , Bonner RF , Smith PD , Chuaqui RF , Zhuang Z. , Goldstein SR , Weiss RA , Liotta LA Lézeres rögzítés mikrodisszekció.  (angol)  // Tudomány (New York, NY). - 1996. - 1. évf. 274. sz. 5289 . - P. 998-1001. — PMID 8875945 .
  8. ↑ HAM RG EMLŐSSEJTEK KLONÁLIS NÖVEKEDÉSE VEGYIleg MEGHATÁROZOTT, SZINTETIKUS KÖZEGBEN.  (angol)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1965. - 1. évf. 53. - P. 288-293. — PMID 14294058 .
  9. ↑ 1 2 3 4 5 Zong C. , Lu S. , Chapman AR , Xie XS Egyetlen emberi sejt egynukleotidos és kópiaszámú variációinak genomszintű kimutatása.  (angol)  // Tudomány (New York, NY). - 2012. - Kt. 338. sz. 6114 . - P. 1622-1626. - doi : 10.1126/tudomány.1229164 . — PMID 23258894 .
  10. ↑ Gole J. , Gore A. , Richards A. , Chiu YJ , Fung HL , Bushman D. , Chiang HI , Chun J. , Lo YH , Zhang K. Egyedi sejtek masszívan párhuzamos polimeráz klónozása és genomszekvenálása nanoliteres mikrolyukak segítségével.  (angol)  // Természet biotechnológia. - 2013. - Kt. 31. sz. 12 . - P. 1126-1132. - doi : 10.1038/nbt.2720 . — PMID 24213699 .
  11. ↑ White AK , VanInsberghe M. , Petriv OI , Hamidi M. , Sikorski D. , Marra MA , Piret J. , Aparicio S. , Hansen CL Nagy áteresztőképességű mikrofluidikus egysejtű RT-qPCR.  (angol)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2011. - 20. évf. 108. sz. 34 . - P. 13999-14004. - doi : 10.1073/pnas.1019446108 . — PMID 21808033 .
  12. ↑ Macosko EZ , Basu A. , Satija R. , Nemesh J. , Shekhar K. , Goldman M. , Tirosh I. , Bialas AR , Kamitaki N. , Martersteck EM , Trombetta JJ , Weitz AK DA , Sanes JR , Shalek Regev A. , McCarroll SA Egyedi sejtek rendkívül párhuzamos genom-szintű expressziós profilozása nanoliter cseppek segítségével.  (angol)  // Cell. - 2015. - Kt. 161. sz. 5 . - P. 1202-1214. - doi : 10.1016/j.cell.2015.05.002 . — PMID 26000488 .
  13. ↑ Thompson AM , Paguirigan AL , Kreutz JE , Radich JP , Chiu DT Microfluidics egysejtű genetikai elemzéshez.  (angol)  // Laboratórium a chipen. - 2014. - Kt. 14. sz. 17 . - P. 3135-3142. - doi : 10.1039/c4lc00175c . — PMID 24789374 .
  14. ↑ Actis P. , Maalouf MM , Kim HJ , Lohith A. , Vilozny B. , Seger RA , Pourmand N. Egysejtes nanobiopsziával feltárt kompartmentális genomika élő sejtekben.  (angol)  // ACS nano. - 2014. - Kt. 8, sz. 1 . - P. 546-553. doi : 10.1021 / nn405097u . — PMID 24279711 .
  15. ↑ 1 2 3 4 Paez JG , Lin M. , Beroukhim R. , Lee JC , Zhao X. , Richter DJ , Gabriel S. , Herman P. , Sasaki H. , Altshuler D. , Li C. , Meyerson M. , Sellers WR A phi29 polimeráz alapú többszálú teljes genom amplifikáció genom lefedettsége és szekvencia hűsége.  (angol)  // Nukleinsavak kutatása. - 2004. - 20. évf. 32. sz. 9 . — P. e71. - doi : 10.1093/nar/gnh069 . — PMID 15150323 .
  16. ↑ Ausubel, FM et al. Vol. I., John Wiley & Songs, Inc. AKTUÁLIS PROTOKOLLOK A MOLEKULÁRIS BIOLÓGIÁBAN. – 1995.
  17. ↑ 1 2 3 4 Hou Y. , Wu K. , Shi X. , Li F. , Song L. , Wu H. , Dean M. , Li G. , Tsang S. , Jiang R. , Zhang X. , Li B. , Liu G. , Bedekar N. , Lu N. , Xie G. , Liang H. , Chang L. , Wang T. , Chen J. , Li Y. , Zhang X. , Yang H. , Xu X. , Wang L. , Wang J. Az egysejtű reszekvenálásban használt teljes genom amplifikációs módszerek közötti eltérések kimutatásának összehasonlítása.  (angol)  // GigaScience. - 2015. - Kt. 4. - P. 37. - doi : 10.1186/s13742-015-0068-3 . — PMID 26251698 .
  18. ↑ 1 2 3 4 5 Huang L. , Ma F. , Chapman A. , Lu S. , Xie XS Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications.  (angol)  // A genomika és a humángenetika éves áttekintése. - 2015. - Kt. 16. - P. 79-102. - doi : 10.1146/annurev-genom-090413-025352 . — PMID 26077818 .
  19. ↑ Chen M. , Song P. , Zou D. , Hu X. , Zhao S. , Gao S. , Ling F. Többszörös elmozdulásos amplifikáció (MDA) és többszörös annealing és looping-based amplifikációs ciklusok (MALBAC) összehasonlítása egyetlen egységben -sejt szekvenálás.  (angol)  // Public Library of Science ONE. - 2014. - Kt. 9, sz. 12 . - P. e114520. - doi : 10.1371/journal.pone.0114520 . — PMID 25485707 .
  20. ↑ 1 2 3 Gawad C. , Koh W. , Quake SR Egysejtű genomszekvenálás: a tudomány jelenlegi állása.  (angol)  // Természetismertetők. genetika. - 2016. - Kt. 17. sz. 3 . - P. 175-188. - doi : 10.1038/nrg.2015.16 . — PMID 26806412 .
  21. ↑ 1 2 Abecasis GR , Auton A. , Brooks LD , DePristo MA , Durbin RM , Handsaker RE , Kang HM , Marth GT , McVean GA Genetikai variáció integrált térképe 1092 emberi genomból.  (angol)  // Természet. - 2012. - Kt. 491. sz. 7422 . - P. 56-65. - doi : 10.1038/nature11632 . — PMID 23128226 .
  22. ↑ Martin ER , Lai EH , Gilbert JR , Rogala AR , Afshari AJ , Riley J. , Finch KL , Stevens JF , Livak KJ , Slotterbeck BD , Slifer SH , Warren LL , Conneally PM , Schmechel - DE . Vance MA , Roses AD , Vance JM SNP-elhárítás komplex betegségektől: az APOE körüli egynukleotidos polimorfizmusok elemzése Alzheimer-kórban.  (angol)  // American Journal of Human Genetics. - 2000. - Vol. 67. sz. 2 . - P. 383-394. - doi : 10.1086/303003 . — PMID 10869235 .
  23. ↑ Zhu Y. , Spitz MR , Lei L. , Mills GB , Wu X. Egyetlen nukleotid polimorfizmus a mátrix metalloproteináz-1 promoterben fokozza a tüdőrák érzékenységét.  (angol)  // Rákkutatás. - 2001. - 20. évf. 61. sz. 21 . - P. 7825-7829. — PMID 11691799 .
  24. ↑ 1 2 Schaschl H. , Aitman TJ , Vyse TJ Másolatszám- variáció az emberi genomban és következménye az autoimmunitásban.  (angol)  // Klinikai és kísérleti immunológia. - 2009. - Vol. 156. sz. 1 . - P. 12-16. - doi : 10.1111/j.1365-2249.2008.03865.x . — PMID 19220326 .
  25. ↑ McKenna A. , Hanna M. , Banks E. , Sivachenko A. , Cibulskis K. , Kernytsky A. , Garimella K. , Altshuler D. , Gabriel S. , Daly M. , DePristo MA The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce keretrendszer a következő generációs DNS-szekvenálási adatok elemzéséhez.  (angol)  // Genomkutatás. - 2010. - 20. évf. 20, sz. 9 . - P. 1297-1303. - doi : 10.1101/gr.107524.110 . — PMID 20644199 .
  26. ↑ Zhang J. , Wheeler DA , Yakub I. , Wei S. , Sood R. , Rowe W. , Liu PP , Gibbs RA , Buetow KH SNPdetector: szoftvereszköz az érzékeny és pontos SNP észleléshez.  (angol)  // Public Library of Science for Computational Biology. - 2005. - 20. évf. 1, sz. 5 . - P. e53. - doi : 10.1371/journal.pcbi.0010053 . — PMID 16261194 .
  27. ↑ Li R. , Li Y. , Fang X. , Yang H. , Wang J. , Kristiansen K. , Wang J. SNP detektálás masszívan párhuzamos teljes genom reszekvenáláshoz.  (angol)  // Genomkutatás. - 2009. - Vol. 19, sz. 6 . - P. 1124-1132. - doi : 10.1101/gr.088013.108 . — PMID 19420381 .
  28. ↑ Koboldt DC , Chen K. , Wylie T. , Larson DE , McLellan MD , Mardis ER , Weinstock GM , Wilson RK , Ding L. VarScan: variánsok detektálása egyedi és egyesített minták masszívan párhuzamos szekvenálásában.  (angol)  // Bioinformatika. - 2009. - Vol. 25, sz. 17 . - P. 2283-2285. - doi : 10.1093/bioinformatika/btp373 . — PMID 19542151 .
  29. ↑ Redon R. , Ishikawa S. , Fitch KR , Feuk L. , Perry GH , Andrews TD , Fiegler H. , Shapero MH , Carson AR , Chen W. , Cho EK , Dallaire S. , Freeman JL , González JR , Gratacòs M. , Huang J. , Kalaitzopoulos D. , Komura D. , MacDonald JR , Marshall CR , Mei R. , Montgomery L. , Nishimura K. , Okamura K. , Shen F. , Somerville MJ , Tchinda J. , Valsesia A. . , Woodwark C. , Yang F. , Zhang J. , Zerjal T. , Zhang J. , Armengol L. , Conrad DF , Estivill X. , Tyler-Smith C. , Carter NP , Aburatani H. , Lee C. , Jones KW , Scherer SW , Hurles ME Globális variáció a kópiaszámban az emberi genomban.  (angol)  // Természet. - 2006. - Vol. 444, sz. 7118 . - P. 444-454. - doi : 10.1038/nature05329 . — PMID 17122850 .
  30. ↑ Zhang F. , Gu W. , Hurles ME , Lupski JR . A példányszám változása az emberi egészségben, betegségekben és evolúcióban.  (angol)  // A genomika és a humángenetika éves áttekintése. - 2009. - Vol. 10. - P. 451-481. - doi : 10.1146/annurev.genom.9.081307.164217 . — PMID 19715442 .
  31. ↑ Frank B. , Bermejo JL , Hemminki K. , Sutter C. , Wappenschmidt B. , Meindl A. , Kiechle-Bahat M. , Bugert P. , Schmutzler RK , Bartram CR , Burwinkel B. Másolatszám- változat a jelölt daganatban Az MTUS1 szuppresszor gén és a családi mellrák kockázata.  (angol)  // Karcinogenezis. - 2007. - Vol. 28, sz. 7 . - P. 1442-1445. - doi : 10.1093/carcin/bgm033 . — PMID 17301065 .
  32. ↑ Glessner JT , Wang K. , Cai G. , Korvatska O. , Kim CE , Wood S. , Zhang H. , Estes A. , Brune CW , Bradfield JP , Imielinski M. , Frackelton EC , Reichert J. , Crawford EL , Munson J. , Sleiman PM , Chiavacci R. , Annaiah K. , Thomas K. , Hou C. , Glaberson W. , Flory J. , Otieno F. , Garris M. , Soorya L. , Klei L. , Piven J. . , Meyer KJ , Anagnostou E. , Sakurai T. , Game RM , Rudd DS , Zurawiecki D. , McDougle CJ , Davis LK , Miller J. , Posey DJ , Michaels S. , Kolevzon A. , Silverman JM , Bernier R. , Levy SE , Schultz RT , Dawson G. , Owley T. , McMahon WM , Wassink TH , Sweeney JA , Nurnberger JI , Coon H. , Sutcliffe JS , Minshew NJ , Grant SF , Bucan M. , Bux EHD , Cookbaum Devlin B. , Schellenberg GD , Hakonarson H. Az autizmus genomra kiterjedő kópiaszám-variációja ubiquitin és neuronális géneket tár fel.  (angol)  // Természet. - 2009. - Vol. 459. sz. 7246 . - P. 569-573. - doi : 10.1038/nature07953 . — PMID 19404257 .
  33. ↑ Xie C. , Tammi MT CNV-seq, egy új módszer a másolatszám-változások kimutatására nagy áteresztőképességű szekvenálás segítségével.  (angol)  // BMC bioinformatika. - 2009. - Vol. 10. - P. 80. - doi : 10.1186/1471-2105-10-80 . — PMID 19267900 .
  34. ↑ Wang K. , Li M. , Hadley D. , Liu R. , Glessner J. , Grant SF , Hakonarson H. , Bucan M. PennCNV: integrált rejtett Markov-modell, amelyet nagy felbontású másolatszám-változások észlelésére terveztek egészben genom SNP genotipizálási adatok.  (angol)  // Genomkutatás. - 2007. - Vol. 17. sz. 11 . - P. 1665-1674. - doi : 10.1101/gr.6861907 . — PMID 17921354 .
  35. ↑ Ivakhno S. , Royce T. , Cox AJ , Evers DJ , Cheetham RK , Tavaré S. CNAseg – egy új keretrendszer a rák kópiaszám-változásainak azonosítására második generációs szekvenálási adatokból.  (angol)  // Bioinformatika. - 2010. - 20. évf. 26. sz. 24 . - P. 3051-3058. - doi : 10.1093/bioinformatika/btq587 . — PMID 20966003 .
  36. ↑ Miller CA , Hampton O. , Coarfa C. , Milosavljevic A. ReadDepth: párhuzamos R-csomag a rövid szekvenálási olvasásokból származó másolatszám-változások észlelésére.  (angol)  // Public Library of Science ONE. - 2011. - 20. évf. 6, sz. 1 . - P. e16327. - doi : 10.1371/journal.pone.0016327 . — PMID 21305028 .
  37. ↑ Klambauer G. , Schwarzbauer K. , Mayr A. , ​​Clevert DA , Mitterecker A. , ​​Bodenhofer U. , Hochreiter S. cn.MOPS: Poissons keveréke a következő generációs szekvenálási adatok kópiaszám-variációinak felfedezéséhez alacsony hamis felfedezéssel mérték.  (angol)  // Nukleinsavak kutatása. - 2012. - Kt. 40, sz. 9 . — P. e69. - doi : 10.1093/nar/gks003 . — PMID 22302147 .
  38. ↑ Ning L. , Liu G. , Li G. , Hou Y. , Tong Y. , He J. Current challenges in the bioinformatics of single cell genomics.  (angol)  // Frontiers in oncology. - 2014. - Kt. 4. - P. 7. - doi : 10.3389/fonc.2014.00007 . — PMID 24478987 .
  39. ↑ Eisen MB , Spellman PT , Brown PO , Botstein D. Klaszteranalízis és genomszintű expressziós minták megjelenítése.  (angol)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1998. - 1. évf. 95, sz. 25 . - P. 14863-14868. — PMID 9843981 .
  40. ↑ Prokopenko D. , Hecker J. , Silverman EK , Pagano M. , Nöthen MM , Dina C. , Lange C. , Fier HL A Jaccard index felhasználása a populáció rétegződésének feltárására a szekvenálási adatokban: szimulációs vizsgálat és alkalmazás az 1000-hez Genome Project.  (angol)  // Bioinformatika. - 2016. - Kt. 32. sz. 9 . - P. 1366-1372. - doi : 10.1093/bioinformatika/btv752 . — PMID 26722118 .
  41. ↑ Greaves M. , Maley C. C. Clonal evolution in cancer.  (angol)  // Természet. - 2012. - Kt. 481. sz. 7381 . - P. 306-313. - doi : 10.1038/nature10762 . — PMID 22258609 .
  42. ↑ A.P. Dempster; NM Laird; D. B. Rubin. Maximális valószínűség a hiányos adatokból az EM algoritmuson keresztül  // Journal of the Royal Statistical Society. B sorozat (Módszertani). - 1977. - 1. évf. 39, 1. sz . - P. 1-38. - doi : 10.2307/2984875 . Az eredetiből archiválva : 2015. december 11.
  43. ↑ C. Fraley, A. E. Raftery. Hány klaszter? Melyik klaszterezési módszer?  Válaszok Modell-alapú klaszterelemzésen keresztül . - 1998. - doi : 10.1093/comjnl/41.8.578 . Archiválva az eredetiből 2017. február 22-én.
  44. ↑ Chris Fraley, Adrian E. Raftery. MCLUST: Software for Model-Based Cluster Analysis  (angol)  // Journal of Classification. - 1999. - doi : 10.1007/s003579900058 . Archiválva az eredetiből 2017. július 22-én.
  45. ↑ 1 2 Kim KI , Simon R. Egysejtes szekvenálási adatok használata tumor evolúciós történetének modellezésére.  (angol)  // BMC bioinformatika. - 2014. - Kt. 15. - P. 27. - doi : 10.1186/1471-2105-15-27 . — PMID 24460695 .
  46. ↑ Falconer E. , Hills M. , Naumann U. , Poon SS , Chavez EA , Sanders AD , Zhao Y. , Hirst M. , Lansdorp PM DNS templátszál szekvenálása egysejtűek genomiális átrendeződéseit térképezi fel nagy felbontásban.  (angol)  // Természeti módszerek. - 2012. - Kt. 9, sz. 11 . - P. 1107-1112. - doi : 10.1038/nmeth.2206 . — PMID 23042453 .
  47. ↑ Falconer E. , Lansdorp PM Strand-seq: a kromoszóma szegregáció tanulmányozásának egyesítő eszköze.  (angol)  // Szemináriumok a sejt- és fejlődésbiológiából. - 2013. - Kt. 24, sz. 8-9 . - P. 643-652. - doi : 10.1016/j.semcdb.2013.04.005 . — PMID 23665005 .
  48. ↑ Coupland P. , Chandra T. , Quail M. , Reik W. , Swerdlow H. Kis genomok közvetlen szekvenálása a Pacific Biosciences RS-en könyvtár előkészítés nélkül.  (angol)  // BioTechniques. - 2012. - Kt. 53. sz. 6 . - P. 365-372. - doi : 10.2144/000113962 . — PMID 23227987 .
  49. ↑ El Hajj N. , Trapphoff T. , Linke M. , May A. , Hansmann T. , Kuhtz J. , Reifenberg K. , Heinzmann J. , Niemann H. , Daser A. , ​​Eichenlaub-Ritter U. , Zechner U. . , Haaf T. A limitált hígítású biszulfit (piro) szekvenálás szülőspecifikus metilációs mintákat tár fel egyetlen korai egérembrióban és szarvasmarha petesejtekben.  (angol)  // Epigenetika. - 2011. - 20. évf. 6, sz. 10 . - P. 1176-1188. - doi : 10.4161/epi.6.10.17202 . — PMID 21937882 .
  50. ↑ Guo H. , Zhu P. , Wu X. , Li X. , Wen L. , Tang F. Embrionális egér embrionális őssejtek és korai embriók egysejtű metilóma tájai, melyeket csökkentett reprezentációs biszulfitszekvencia segítségével elemeztünk.  (angol)  // Genomkutatás. - 2013. - Kt. 23. sz. 12 . - P. 2126-2135. - doi : 10.1101/gr.161679.113 . — PMID 24179143 .
  51. ↑ Nagano T. , Lubling Y. , Yaffe E. , Wingett SW , Dean W. , Tanay A. , Fraser P. Egysejtű Hi-C egyetlen sejtben egyidejűleg fellépő kromatinkölcsönhatások genomszintű kimutatására.  (angol)  // Természeti protokollok. - 2015. - Kt. 10, sz. 12 . - P. 1986-2003. - doi : 10.1038/nprot.2015.127 . — PMID 26540590 .
  52. ↑ 1 2 Macaulay IC , Voet T. Egysejtes genomika: előrelépések és jövőbeli kilátások.  (angol)  // PLoS genetika. - 2014. - Kt. 10, sz. 1 . — P. e1004126. - doi : 10.1371/journal.pgen.1004126 . — PMID 24497842 .