Szekvenálás

Biopolimerek ( fehérjék és nukleinsavak  - DNS és RNS ) szekvenálása - aminosav vagy nukleotid szekvenciájának meghatározása (a latin  szekventum szóból  - szekvencia). A szekvenálás eredményeként egy lineáris makromolekula elsődleges szerkezetének formális leírását kapjuk monomerek sorozata formájában szöveges formában. A szekvenálandó DNS-szegmensek mérete általában nem haladja meg a 100 bázispárt (következő generációs szekvenálás) és az 1000 bázispárt Sanger-szekvenálás esetén. Az egymást átfedő DNS-szakaszok szekvenálása eredményeként génszekvenciákat, teljes géneket , teljes mRNS -t vagy szervezetek teljes genomját kapjuk [1] [2] .

A szekvenáláshoz Edman , Sanger és mások módszereit használjuk; jelenleg a didezoxinukleozid-trifoszfátokkal ( ddNTP ) végzett Sanger-módszert használják génszekvenálásra. Általában a szekvenálás előtt a szekvenálandó DNS-szakaszt PCR- rel amplifikálják . A teljes genom szekvenálását általában a következő generációs szekvenálási technológiákkal végzik .

Sanger szekvenálás

A didezoxinukleotid módszert vagy a „láncvégződési” módszert F. Sanger fejlesztette ki 1977 -ben , és jelenleg széles körben használják a DNS nukleotidszekvenciájának meghatározására. A Sanger-szekvenálás egy 17-20 nt hosszúságú szintetikus oligonukleotidot hibridizál a szekvenált hely egyik láncában egy specifikus hellyel. Ez az oligonukleotid egy primer , amely egy 3'-hidroxilcsoportot biztosít a templáttal komplementer lánc szintézisének elindításához.

A primer oldatot négy csőre osztjuk, amelyek mindegyike négy dezoxinukleotidot, dATP-t, dCTP-t, dGTP-t és dTTP-t (melyek közül az egyik radioaktívan jelölt) , valamint négy 2',3'-didezoxinukleotidot (ddATP, ddTTP, ddGTP vagy ddCTP) tartalmaz. . A didezoxinukleotid a növekvő láncok keverékében minden pozícióban benne van, és rögzítése után a lánc növekedése azonnal leáll.

Ennek eredményeként mind a négy kémcsőben, a DNS-polimeráz részvételével , egyedi, különböző hosszúságú oligonukleotid-készlet jön létre, beleértve a primerszekvenciát is. Ezenkívül formamidot adnak a kémcsövekhez a láncok szétválasztására, és poliakrilamid gélben négy sávban elektroforézist hajtanak végre . Végezzen autoradiográfiát , amely lehetővé teszi a szekvenált DNS-szegmens nukleotidszekvenciájának „olvasását”.

Egy modernebb változatban a didezoxinukleotidokat négy különböző fluoreszcens festékkel jelölik, és egy csőben végzik a PCR -t. Ezután a poliakrilamid gélelektroforézis során a gél egy bizonyos pontján egy lézersugár gerjeszti a festékek fluoreszcenciáját, és a detektor meghatározza, hogy éppen melyik nukleotid vándorol át a gélen. A modern műszerek kapilláris elektroforézist használnak a DNS-szekvenáláshoz . [3]

High Efficiency Sequencing

Lásd még

• Edman módszer
• Biszulfit szekvenálás
• Piroszekvenálás
• Következő generációs szekvenálási módszerek
• Egysejtes DNS szekvenálás

Jegyzetek

1. ↑ Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J. A sejt molekuláris biológiája: három kötetben. - 2. - Moszkva: Mir, 1994. - T. 1. - 517 p. — 10.000 példány.  — ISBN 5030019855 .
2. ↑ Knorre D. G., Myzina S. D. Biological chemistry. - 3. - Moszkva: Felsőiskola, 2000. - 479 p. - 7000 példány.  — ISBN 5060037207 .
3. ↑ Glik B., Pasternak J. Molekuláris biotechnológia. Alapelvek és alkalmazás. - Moszkva: Mir, 2002. - 589 p. — ISBN 5030033289 .

Irodalom

• Glick B., Pasternak J. Molekuláris biotechnológia. Alapelvek és alkalmazás. - Moszkva: Mir, 2002. - 589 p. — ISBN 5030033289 .

Linkek

• Életkód: olvasni nem érteni
• UniProt.Protein szekvencia és funkcionális információk.
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4727787/
• https://www.longdom.org/open-access/generations-of-sequencing-technologies-from-first-to-next-generation-0974-8369-1000395.pdf
• https://www.creative-biogene.com/blog/index.php/2016/11/01/brief-introduction-on-three-generations-of-genome-sequencing-technology/
• https://www.nature.com/articles/nbt1486 (2008)

Szótárak és enciklopédiák	Nagy orosz