Az exome szekvenálás a genomban található összes fehérjét kódoló gén ( azaz exome ) szekvenálása . Az exome szekvenálás két műveletre vonatkozik: először az exon szelekcióra . Az exonok szervezettől függően a genom 1-2%-át fedik le [1] . Emberben körülbelül 180 000 van belőlük, a teljes genom körülbelül 1%-a , vagyis körülbelül 30 millió bázispár (bp). Másodszor, exon szekvenálás bármilyen nagy áteresztőképességű DNS szekvenáló platform segítségével és a kapott eredmények elemzése [2] .
Az exome szekvenálás lehetővé teszi olyan genetikai változások kimutatását, amelyek a fehérjeszekvenciák megváltozásához vezetnek, ami viszont olyan betegségekhez vezethet, mint az érelmeszesedés , az Alzheimer-kór és mások. Az exome szekvenálás fő előnye a gének tömeges szűrésének és a betegségekkel kapcsolatos mutációk kimutatásának képessége, miközben ez az eljárás egyszerűbb és olcsóbb, mint a teljes genom szekvenálás [1] .
Az exome szekvenálás négy szakaszból áll: DNS extrakció a szolgáltatott anyagból, a kérdéses DNS -frakció kiválasztása (minta dúsítás), a kiválasztott anyag szekvenálása és a kapott eredmények elemzése [3] .
Az első lépés a rendelkezésre álló mintákból kiváló minőségű genomiális DNS - preparátumok előállítása a DNS fehérjéktől , lipidektől stb. A DNS izolálásának standard módszere a fenol-kloroform keverékével történő extrakció [ 4] .
A minta dúsítási stratégiák lehetővé teszik a kívánt genomi régiók, azaz exonok szelektív szelekcióját a DNS-mintákból a szekvenálási lépés előtt. Az első eredeti módszer 2005-ös leírása óta számos exome szekvenálási célokra alkalmas minta-dúsítási stratégia született [5] . A konkrét módszer kiválasztása az érdeklődésre számot tartó régiók méretétől, a szekvenálási lefedettség igényétől, a rendelkezésre álló berendezésektől és egyéb okoktól függ [6] .
Polimeráz láncreakcióA polimeráz láncreakciót (PCR) több mint 20 éve széles körben alkalmazzák a szükséges DNS-fragmensek amplifikálására [7] . Általában csak 2 primert használnak a PCR -ben, azonban olyan multiplex PCR módszereket fejlesztettek ki, amelyek több primert használnak, és lehetővé teszik több cél-DNS egyidejű amplifikációját egyetlen folyamatban. A PCR-megközelítések nagyon hatékonyak, de nem teszik lehetővé több millió bp hosszúságú genomrégiókkal való munkát. a kapott minták magas ára és alacsony minősége miatt [1] .
Molekuláris inverziós módszerA molekuláris inverziós módszer egy olyan technika, amely lehetővé teszi a célszekvenciák amplifikált fordított régióival dúsított DNS-minták kinyerését . A kívánt szekvenciák kiválasztása a gyűrűben lévő érdeklődési terület bezárása miatt történik. A primer itt egy egyszálú DNS- oligonukleotid , amelynek középső része egy univerzális szekvenciát tartalmaz restrikciós helyekkel , és a végei komplementerek a genomi DNS két szakaszával, amelyek között a számunkra érdekes szekvencia található. A nem reagált minták lineárisak maradnak, és az exonukleázok eltávolítják őket [5] [8] . A módszer hasznos lehet kis számú célponttal való munkavégzéshez nagyszámú mintában. A fő hátrány a kapott minták egyöntetűsége, valamint a magas ár, ha szükséges, nagy területhalmaz lefedésére [7] .
Hibridizációs dúsításA minták exomrégiókkal való hibridizációs dúsításához speciális mikromátrixokat hoznak létre , amelyek egyszálú oligonukleotidokat ( próbákat ) tartalmaznak, amelyek egy szubsztráthoz vannak rögzítve a genomból származó szekvenciákkal, amelyek lefedhetik a kérdéses régiókat. A genomi DNS-t fragmensekre vágják. A fragmensek végeit restrikciós enzimekkel tompítják en] , univerzális primerekkel ellátott adaptereket adnak hozzá . A fragmensek próbákkal történő hibridizálása után microarray-eken a nem hibridizált fragmenseket lemossák a szubsztrátról, majd a maradékokat PCR-rel amplifikálják [5] . A módszer korlátai a berendezés magas költségével, a mátrixra helyezhető próbák számával, valamint az elemzéshez kellően nagy mennyiségű DNS szükségességével kapcsolatosak [1] .
Dúsítás az oldatbanAz oldatban egy sor szondát szintetizálnak, amelyeket streptavidin gyöngyökre rögzítenek. A gyöngyöket fragmentált genomiális DNS-t tartalmazó oldatba helyezzük, ahol a próbák szelektív hibridizációja megy végbe a kívánt genomi régiókkal, majd a gyöngyöket a kívánt fragmentumokkal kicsapjuk és mossuk. A fennmaradó részek ezután sorrendbe kerülnek. Ezt a módszert a hibridizációs dúsítási módszer javítására fejlesztették ki: lehetővé teszi, hogy a szükséges mintamennyiséghez képest több próbát hozzon létre a célhelyekre. A cél DNS-régió optimális mérete körülbelül 3,5 millió bp, így a későbbi szekvenálás jó lefedettséget eredményez [7] .
Az exome dúsítására használt platformokAz exome dúsító platformok fő szolgáltatói a NimbleGen , az Agilent és az Illumina [1] .
| A NimbleGen SeqCap EZ Exome könyvtára | Az Agilent Sure Select Human All Exon készlete | Az Illumina TruSeq Exome dúsító készlete | Az Illumina Nextera Rapid Capture Exome készlete | |
|---|---|---|---|---|
| A szonda hossza | 55-105 [9] | 114-126 [9] | 95 | 95 |
| A DNS minta ajánlott mennyisége | 3 μg [10] | 3 μg [10] | 500 ng [10] | 50 ng [10] |
| Nukleinsav típusú próba | DNS | RNS | DNS | DNS |
| Érdeklődési töredék vizsgálati lefedettségi stratégiája | Átfedő szondák [9] | Gyakrabban szigorúan szekvenciális szondák, mint átfedők | Hézagok a próbaszekvenciák között (a próbák bizonyos távolságra vannak egymástól a fragmentumszekvencia mentén) | Hézagok a próbaszekvenciák között |
| fragmentációs módszer | Ultrahang | Ultrahang | Ultrahang | transzponálás |
| Céltöredék mérete (emberi) | 64 | ötven | 62 | 62 |
| A szűrés után hátralévő | 66% | 71,7% | 54,8% [11] | 40,1% |
| Fő erősségei | Magas érzékenység és specifitás. A legegyenletesebb lefedettség a nehéz régiókban [9] [12] [13] . | Jó lefedettség az indelekről [9] [13] [11] . Magas szintezési sebesség . Kevesebb újraolvasás, mint más platformokon [13] . | Jó lefedettség a nem lefordított régiókra és miRNS -ekre [9] | Jó lefedettség a nem lefordított régiókra és miRNS-ekre |
| Fő gyengeségek | Több az újraolvasás, mint az Agilent. Lassabb szintezési sebesség. | Gyengébb minőségű olvasás, mint a NimbleGen [12] | Magas szintű nem célzott dúsítás [9] | Magas szintű nem célzott dúsítás. Offset lefedettség magas GC-tartalmú területeken , csökkentve az egyenletességet. |
| Az emberi szekvenciákon túli felhasználás | Igen | Igen | Nem | Nem |
Jelenleg a csak embernek szánt készletek mellett a NimbleGen kukorica- , árpa- , búza- , szója- , egér- és sertés -exomákhoz kínál készleteket, míg az Agilent egér-, szarvasmarha- és zebrahal -exomákhoz kínál készleteket . Mindkét gyártó lehetőséget kínál egyéni készletek tervezésére más fajokhoz is. A nem emberi fajokhoz készült készletek a gyártók emberi készleteihez hasonló protokollokat és szondákat használnak. Mindkét gyártó rugalmas tervezési folyamatot kínál, amely lehetővé teszi a változtatások végrehajtását az adott régiók és célok lefedettségének javítása érdekében [1] .
Számos szekvenálási technológia létezik, köztük a klasszikus Sanger szekvenálási módszer . A következő generációs szekvenálási módszerek az Illumina , SOLiD és Ion-Torrent platformokat használják . Mindezek a módszerek exome szekvenálásra is használhatók [14] .
Az elsődleges szekvenálási adatok kis sorozatok (leolvasások) hatalmas halmaza, amelyek hossza és minősége a szekvenszer műszaki jellemzőitől és a minta-előkészítés módjától függ. A leolvasások minősége szabályozható például a FastQC szoftvercsomag segítségével [15] . Az így kapott leolvasásokat szűrjük: levágjuk a végszakaszokat, amelyekben gyakran nagy számú hiba van, az adapterszekvenciákat eltávolítjuk (például Trimmomatic [16] vagy sarló [17] használatával ); majd a hibákat kijavítják (például a Blucoo [18] és a Lighter [19] programokkal ). A szűrt leolvasásokat a genomra térképezzük fel, ahol exonoknak megfelelő szekvenciákká állnak össze. Jelenleg sok olyan program létezik, amely a szekvenálási adatok előkészítésének és elemzésének minden szakaszát elvégzi, ezek többsége nagy számítási teljesítményt igényel , mivel a beérkező adatok mennyisége nagyon nagy [20] .
Exome szekvenálás segítségével a fix költségű vizsgálatok során szignifikánsan nagyobb lefedettségű szekvenciákat szekvenálhatunk, mint a teljes genom szekvenálási módszerekkel kapott lefedettség. Emiatt az exome szekvenálást gyakrabban alkalmazzák olyan problémák megoldására, amelyek az egynukleotidos polimorfizmusok megbízható meghatározását igénylik [21] .
2011. szeptember 29-én az Ambry Genetics lett az első olyan tanúsított vállalat, amely az exome szekvenálást és az arra épülő betegségdiagnosztikát kínálta [22] . A vállalat azt állítja, hogy az exome szekvenálás eredményei lehetővé teszik az alkalmazottak számára olyan betegségek diagnosztizálását, amelyekben a hagyományos diagnosztikai módszerek nem alkalmazhatók [23] .
A betegséget okozó mutációk azonosítása jelentősen hozzájárulhat a diagnosztikai és terápiás megközelítésekhez, elősegítheti a betegség kialakulásának előrejelzését, és lehetővé teszi a veszélyeztetett rokonok vizsgálatát [2] [24] [25] [26] [27] [28 ] ] . Számos oka van annak, hogy az exome szekvenálást előnyben részesítik a monogén elemzéssel szemben: az atipikus klinikai megjelenés miatt nem tesztelt gének mutációinak azonosítása [28] , valamint azon klinikai esetek azonosítása, amelyekben a különböző gének mutációi különböző megnyilvánulásokat okoznak a ugyanaz a beteg [24] . Ezenkívül a módszer lehetővé teszi a betegségek korai stádiumban történő diagnosztizálását és fiatal betegeknél a jellemző tünetek teljes spektruma megjelenése előtt; prenatális diagnosztikára is használják [1] Egyes esetekben a prenatális exome szekvenálás képes kimutatni a genetikai betegségeket , míg a standard módszerek ( kariotipizálás és microarray) hatástalanok [29] .
Az exome szekvenálásról szóló mérföldkőnek számító, lektorált publikáció szerzői kiemelik ennek a módszernek a klinikai gyakorlatban való hasznosságát. A szerzők, akik exome szekvenálást alkalmaztak a Bartter-szindrómát és a veleszületett kloridos hasmenést okozó mutáció azonosítására , kijelentik: „Úgy képzeljük el a jövőt, hogy ezek az információk a genetikai betegségek gyanújával rendelkező betegek rutin klinikai értékelésének részévé váljanak. tisztázatlan diagnózis ... Úgy gondoljuk, hogy a teljes exome szekvenálás nagymértékben hozzájárul majd annak megértéséhez, hogy mely gének és milyen módon vesznek részt a ritka és gyakori emberi betegségek kialakulásában, valamint a klinikai gyakorlatban” [25] .
Ritka polimorfizmusok feltérképezése komplex rendellenességekben és Mendel-betegségekbenA folyamatban lévő nagy nemzetközi vizsgálatok célja a genomban előforduló, modern módszerekkel legkönnyebben azonosítható polimorfizmusok azonosítása. A negatív szelekció miatt azonban a rendkívül súlyos betegségeket, különösen a mendeli betegségeket okozó polimorfizmusok szignifikánsan alacsonyabb allélgyakorisággal fordulnak elő, és a jelölt gének modern standard genotipizálási módszerekkel történő keresése során felderítetlenek maradhatnak , és leggyakrabban az exomon belül található. Mivel a komplex betegségekben nagyszámú gén társul a megbetegedések kockázatával, ezek kimutatásához nagyon nagy mintaméretekre van szükség, így költségszempontból a teljes genom szekvenálása nem optimális. Emellett nagyon részletesen tanulmányozzák a kódoló régiókban előforduló polimorfizmusokat, és könnyebben meghatározható funkcionális jelentőségük [30] A mendeli gének azonosításának sikeres modellje a gének szekvenálásából adódó de novo polimorfizmusok azonosítása. két szülő és egy leszármazott [31] .
A növényi genomok rendkívül összetettek, ismétlődőek és gyakran poliploidok lehetnek ; ennek eredményeként a gazdaságilag legfontosabb növények egy része nem vizsgálható teljes genom szekvenálás segítségével. A felhalmozott transzkripciós adatokon [32] alapuló búza exome dúsítási készletet fejlesztettek ki , amelynek segítségével tanulmányokat végeztek az exóm nemkívánatos intrakulturális genetikai heterogenitására , amely befolyásolja a növény fenotípusát , különösen a növekedési sebességet, a növekedési képességet. különféle körülmények között élnek, és más, a tenyésztési tulajdonságok szempontjából fontosak. Hasonló készleteket használtak az Oryza sativa rizs [33] és a szójabab Glycine max [34] vizsgálatakor . Lehetőség van olyan genetikai markerek azonosítására is , amelyek felelősek a növényi kultúrák bizonyos kórokozókkal szembeni specifikus rezisztenciájáért [35] .
Egyes esetekben az exome szekvenálás a drágább teljes genom szekvenálás alternatívájaként használható, például a populációkon belüli és a populációk közötti genetikai variációk tanulmányozása során [36] .
A microarray technikákhoz ismert szekvenciájú hibridizációs próbák szükségesek, így ezek korlátozottak a próbatervezés követelményei miatt, és nem tudnak bizonyos genetikai változásokat kimutatni. Az exome szekvenáláshoz használt nagy áteresztőképességű szekvenálási technológiák sokkal nagyobb számú lókusz szekvenciájának egyidejű felismerését és számos betegség eddig ismeretlen forrásának azonosítását teszik lehetővé [37] , azaz megkerülhetik a genotipizáló chipek és a klasszikus szekvenálás [38] .
Az exome szekvenálás drágább eljárás, de a pénzügyi költségek csökkenésével és a szekvenálási módszerek termelékenységének növekedésével ezt a módszert egyre gyakrabban alkalmazzák a gyakorlatban ritka genetikai betegségek diagnosztizálására [39] .
Egyes betegségekhez társulhatnak a nem kódoló régiók mutációi vagy szerkezeti átrendeződések, amelyeket az exome szekvenálás nem mutat ki [2] . De a tudomány és a technológia fejlődésének jelenlegi szakaszában a teljes genom szekvenálásának magas költsége miatt az exome szekvenálás tűnik a legjobb módszernek olyan ritka örökletes betegségek klinikai diagnosztizálására, amelyeket a microarray-ek nem mutatnak ki [25] .
Az exome szekvenálás során nagy mennyiségű adat statisztikai elemzése külön időigényes feladat. Számos megközelítés létezik az exome adatok minőségének javítására [2] :
Egyes biológiai fajok esetében a genom összeállítás és annotáció minősége sokkal rosszabb, mint az embernél (vagy egyáltalán nincs szekvenált genom). Ez jelentősen korlátozza az exome szekvenálás alkalmazását más organizmusokra, mivel megnehezíti a DNS-minták dúsítását és a szekvenálási eredmények genomra való feltérképezését [1] .