A rövid nyitott leolvasási keretek [1] ( angolul upstream open reading frames, uORF ) olyan nyitott olvasási keretek ( angl . open reading frame, ORF ) , amelyek az eukarióta és néhány vírus 5'-nem lefordított régiójában (5'-UTR) belül helyezkednek el [2]. mRNS . Az uORF-ek részt vesznek a génexpresszió szabályozásában eukariótákban és vírusokban [3] [4] , és általában elnyomják a fő leolvasási keret (azaz az kódoló szekvencia ) transzlációját , bár hatásukat különféle hatások kísérhetik [ 5] .
Általában az mRNS egy 5'-nem transzlált régióra (5'-UTR), egy nyitott leolvasási keretre (CDS), amely egy startkodonnál kezdődik és egy stopkodonnál végződik, valamint egy 3-as nem transzlált régióra (3'- ) van felosztva. UTR). A rövid nyitott olvasási keretek (uORF-ek) a fő olvasási keret előtti 5'-UTR-ben találhatók. Az uORF azonban átfedésben lehet a fő kódoló szekvenciával ( eng. coding sequence, CDS ), ekkor a stopkodonja a CDS iniciátor kodon után helyezkedik el [1] .
Az uORF-ek a humán mRNS-ek 5'-UTR-jének körülbelül 50%-ában és az emlős mRNS-ek legalább 35%-ában vannak jelen [1] , jelenlétük pedig a génexpresszió csökkenését okozza, 30%-kal csökkentve a funkcionális mRNS és a fehérje mennyiségét. képződés 30-80%-kal. A rövid nyitott leolvasási keret (uAUG) startkodonjához kötődő riboszómák elindítják az uORF transzlációját, ami hátrányosan befolyásolhatja a fő leolvasási keret (azaz a kódoló régió) transzlációjának hatékonyságát. Ha a kódoló régióban nincs hatékony kötődés a riboszómának a startkodonhoz (vagyis a transzláció megindítása), akkor ennek hatására csökken a fehérjeképződés szintje, és ezáltal a megfelelő gén expressziós szintje. Fordított helyzet is előfordulhat: az uORF transzlációja tovább folytatódik a kódoló régió transzlációjává, és ennek eredményeként túl hosszú fehérje képződik, amely káros lehet a szervezetre.
A transzlációs hatékonyság csökkenése az uORF jelenléte miatt az 5'-UTR-ben jól tanulmányozott hatás; az egyik példa, amely ezt illusztrálja, a poli(A)-polimeráz α ( poli( A )-polimeráz α, PAPOLA ) gén , amelynek mRNS-e két erősen konzervált uORF-et tartalmaz az 5'-UTR-ban. A proximális uAUG mutációja növeli ennek az mRNS-nek a transzlációjának hatékonyságát, ezért az uORF jelentősen csökkenti ennek a génnek az expresszióját. Egy másik példa a pajzsmirigyhormon-receptor , amely számos célgén transzkripcióját aktiválja vagy elnyomja: a transzlációját egy 15 nukleotidból álló uORF hajtja végre mRNS-ének 5'-UTR- jában [6]. .
Az általános vélekedés szerint az uORF-ek csökkentik a transzláció hatékonyságát, mivel az uORF transzlációjának befejeződése után a riboszóma nem tudja újraindítani a transzlációt és lefordítani a kódoló régiót. Kimutatták, hogy a sikeres fordítás újraindításához az uORF hossza nem haladhatja meg a 20 kodont, de erre a tényre még mindig nincs kielégítő magyarázat [1] . Bizonyos esetekben és bizonyos feltételek mellett az uORF startkodont figyelmen kívül hagyhatja a pásztázó riboszóma. Ugyanakkor egyes belső és külső tényezők hatására az uORF gátló hatása fokozódhat, és ezen korlátozó tényezők közül a főként az iniciációs komplex elérhetősége az uORF transzláció befejeződése után [7] .
Azonban a közelmúltban végzett több mint 500 5'-UTR-t tartalmazó génlókusz vizsgálata kimutatta, hogy nincs határozott kapcsolat az uORF-nek a következő gén expressziójára gyakorolt hatása és az uORF és a kódoló szekvencia közötti távolság között . A tanulmány szerzői ugyanakkor azt sugallják, hogy az egyetlen uORF-et tartalmazó génekben a CDS-transzláció nagy valószínűséggel az uORF-nek a riboszómával történő letapogatása után következik be, annak disszociációja nélkül, és nem a transzláció újrakezdése révén. Ez a feltevés nagymértékben eltér Kozak (1987) következtetéseitől és általában az összes korábbi uORF-felfogástól (akkor minden esetben helyesnek tartották azt a szabályt, amely szerint a riboszóma az első startkodontól kezdi meg a transzlációt, akkor találkozik, amikor az 5'-végről a 3'-végi mRNS-re mozog [8] ).
Ezenkívül a Rent1-et (a hibás mRNS-ek irányított elpusztításának folyamatában szerepet játszó faktor – nonszensz által közvetített bomlás, NMD ) hiányzó sejtekkel végzett kísérletek azt mutatták, hogy NMD hiányában az uORF-et tartalmazó átiratok sikeresen lefordíthatók. Ez azt mutatja, hogy az NMD ezen átiratok működésének szabályozásában is fontos szerepet játszik. Valószínűleg több lehetőség is van az uORF és a riboszóma kölcsönhatását követő események kialakulására: a transzláció folytatása, a szkennelés folytatása vagy a kódoló régió transzlációjának újraindítása, és hogy ezek közül melyik fog bekövetkezni, attól függ számos tényező.
GCN4Így az élesztő GCN4 gén mRNS-e , amely egy transzkripciós aktivátort kódol, 4 uORF-et tartalmaz az 5'-UTR-ben, és ezek közül csak az egyik teszi lehetővé, hogy a riboszóma megkezdje a kódoló régió transzlációját. A hatékony újraindítást az uORF két oldalán elhelyezkedő két cisz - fokozó segíti elő. További vizsgálatok kimutatták, hogy az 5'-cisz-aktiváló szekvencia (enhancer) kölcsönhatásba lép az eIF3 iniciációs faktor eIF3A /TIF32 alegységének N-terminális doménjével , aminek eredményeként a 40S riboszóma alegység megmarad. az mRNS-en az uORF1 transzlációja után, és folytatja a szkennelést. Azt is megállapították, hogy az újrakezdést elősegíti az mRNS specifikus hajtogatása a riboszóma szkennelés során, és ez a hajtogatás lehetővé teszi, hogy az enhanszer kölcsönhatásba lépjen egy másik mRNS-szekvenciával. Ez csak egy példa az uORF gén kiütésére, de mostanra világos, hogy a kiütési mechanizmus sokkal összetettebb, mint azt a szkennelési modell sugallja. További kutatások szükségesek ennek a mechanizmusnak vagy mechanizmusoknak a részletes tisztázásához [9] .
Protein kináz CEgy másik példa, amely az uORF által közvetített génleállási mechanizmusok összetettségét illusztrálja, a protein kináz C ( PKC ) . A PKC a szerin/treonin protein kináz család tagja, amely részt vesz a sejtnövekedés és -differenciálódás szabályozásában . Új izoformája , a PKCη szövetspecifikus, és főleg gyorsan változó sejtekben, például hámsejtekben expresszálódik . A közelmúltban azt találták, hogy ez az izoforma specifikus szerepet játszik a stresszre adott válaszban , és expressziója korrelál a rákellenes gyógyszerekkel szembeni rezisztenciával számos rák esetében . A humán PKCη 5'-UTR egy hosszú (659 nukleotid), GC -ben gazdag szekvencia, és 2 kis konzervált uORF-et tartalmaz. Mindegyik uORF mutációja enyhe növekedést (1,5 és 2,2-szeres) okoz a fő ORF expressziójában, és mindkét mutáció háromszoros növekedést okoz. Úgy tűnik, a PKCη transzláció elnyomásának mechanizmusa normál körülmények között megy végbe. Stressz körülmények között ( glükóz hiánya vagy hipoxia ) két uORF is részt vesz az expresszióban, mivel ezek az 5'-UTR gyenge letapogatását biztosítják, és növelik a kódoló szekvencia transzlációját. A transzkriptumhoz kötött riboszómák számának változása és az egyes uORF-ek transzlációja a génexpresszió sejtspecifikus „hangolását” is biztosíthatja [10] .
Ornitin-dekarboxilázMegállapítást nyert, hogy az AUG mellett az AUG-tól egy nukleotidban eltérő kodonok is használhatók transzkripciós starthelyként, és az iniciáció hatékonyságát minden esetben a nem szabványos startkodon környezete határozza meg. Így a poliaminok bioszintézisében részt vevő ornitin- dekarboxiláz ( eng. ornithine decarboxylase, ODC ) expresszióját az uORF modulálja az AUU startkodonnal. Az iniciáció hatékonysága ebben az esetben a poliaminok intracelluláris koncentrációjától függően változik, míg az AUU iniciáció hatékonysága erősen csökken a poliaminokban kimerült sejtekben: a fő ORF transzlációs hatékonyságának 18%-a, a telített sejtekben. poliaminokkal ez 54%. Így a csökkent ODC-expresszió megmarad poliaminok jelenlétében. Ez a példa azt mutatja, hogy valószínűleg sokkal nagyobb számú uORF létezik, mint azt korábban gondolták [10] .
Ornitin-dekarboxilázBár a legtöbb uORF negatívan befolyásolja a génexpressziót, néha az uORF-ek jelenléte fokozza a transzlációt. Példa erre a HIV -1 vírus bicisztronos vpu-env mRNS -e , amely egy nagyon kis méretű konzervált uORF-et tartalmaz. Ez az uORF mindössze 5 nukleotiddal az AUG vpu előtt található, és hamarosan az AUG vpu - val átfedő stopkodonnal végződik . Úgy találták, hogy ez az uORF jelentős jótékony hatással van az env fordításra anélkül, hogy zavarná a vpu fordítást . Olyan mutánsokat kaptunk, amelyekben az uORF és a fő AUG közötti távolság 5 nukleotiddal nőtt, és kimutatták, hogy az uORF nem vesz részt a vpu iniciációjában . Ennek alapján a tanulmány szerzői felvetették, hogy ez a kis uORF riboszóma retardációs helyként szolgálhat, melynek során a riboszóma kölcsönhatásba lép a promócióját elősegítő RNS - struktúrákkal, azaz fizikailag legyőzi az 5'-UTR részt, hogy elérje a fő iniciációs kodon [11] .
RNáz HAz elmúlt évtizedben kimutatták, hogy a génexpresszió uORF általi szabályozása összetett folyamat. Az ilyen összetett szabályozás jó példája a következő mechanizmus. Az RNáz H1 jelen van az emlőssejtek sejtmagjában és mitokondriumában , és eltérő módon expresszálódik a különböző sejttípusokban. Ennek az enzimnek az izoformáinak expresszióját két intraframe startkodon, az AUG, valamint az uORF szabályozza, amelyek az 5'-UTR-ben lokalizálódnak. Az RNáz H1 transzlációja a mitokondriumokban az első AUG kodonnál kezdődik, és általában az uORF-re korlátozódik, így a mitokondriális izoform mennyisége körülbelül 10%-a a nukleáris izoformának. A nukleáris izoforma transzlációja a második AUG-tól kezdődik, és nem függ az uORF-től, mivel a riboszóma képes hatékonyan újraindítani a transzlációt a második AUG-tól, mintha kihagyná az uORF-et. Ez a szabályozó mechanizmus lehetővé teszi az RNáz H1 expressziójának szabályozását a mitokondriumokban, ahol annak feleslege sejthalálhoz vezethet anélkül, hogy befolyásolná a nukleáris izoforma normál expressziós szintjét. Azt is megállapították, hogy az AUG nukleotid-környezetében bekövetkezett változás transzkriptum-felhalmozódást okozott, ami arra utal, hogy más tényezők is szerepet játszanak ebben a mechanizmusban. Ez a példa egy nagyon specifikus génexpresszió-szabályozó rendszert mutat be, amelyben az uORF és más tényezők is szerepet játszanak [12] .
Végül, az alternatív promóterek és a splicing , valamint az a tény, hogy a riboszóma időnként kölcsönhatásba léphet a kereten kívüli kodonokkal, és nem szabványos startkodonokat használhat , további lehetőségeket kínál a génexpresszió szabályozására az uORF részvételével. Egy nemrégiben végzett humán monocita sejtvonalon , amelyet puromicinnel kezeltek korai transzlációs termináció és transzlációs iniciációs helyek meghatározására, 2994 új uORF-et mutattak ki csak az 5'-UTR-ban, bár bizonyos, hogy sok uORF is átfedésben van a kódoló régióval. a 3'-UTR [13] .
Az uORF-ek tényleges nukleotidszekvenciája általában nem befolyásolja hatásukat; csak az uORF-ek hossza, száma és távolsága [7] fontos . Egyes esetekben azonban az uORF hatása továbbra is a nukleotidszekvenciájától, különösen az általa kódolt peptid aminosavszekvenciájától függ [14] . Bár az uORF-ek, mint a riboszóma kötődés és transzláció szabályozásában részt vevő szabályozó elemek jelentősége jól ismert, az uORF által kódolt peptidek funkciója, sőt sorsa gyakran ismeretlen, valószínűleg a peptidek expressziós szintjének és lokalizációjának elemzése során felmerülő nehézségek miatt. . 2004-ben bizonyítékot szereztek arra, hogy az uORF által transzlált peptidek jelen vannak a sejtekben, amikor 54 100 aminosavnál rövidebb peptidet azonosítottak. Ezeket a peptideket humán krónikus mieloid leukémia sejtekben termelték, amelyek mindegyike uORF-et tartalmaz. Bár ezeket a peptideket azonosították, nem ismert, hogy ezekben a sejtekben több ezer uORF-ek termelnek kísérletileg azonosítható fehérjéket. Ez azt jelezheti, hogy először is az uORF-ből transzlált fehérjéket szelektíven proteolízisnek lehet alávetni ; másodszor, néhány uORF expresszálódik, de nem az ilyen típusú sejtekben; harmadszor, sok uORF nem termel fehérjéket. Nyilvánvaló azonban, hogy egyes uORF-ek még mindig olyan peptidekké alakulnak, amelyek felhalmozódnak a sejtekben, és ezért látszólag funkcionális terhelést hordoznak, bár sokak számára ez még nem ismert [12] .
Bizonyos esetekben azonban az uORF által kódolt peptidek hatásmechanizmusa ismert. Az ilyen peptid cisz -szabályozó elemként működik, és kapcsolatban marad a transzláló riboszómával. Úgy tűnik, hatásmechanizmusa a peptidnek a riboszómával való specifikus kölcsönhatásával függ össze, ami késlelteti a terminációt, és lehetetlenné teszi a riboszóma további mozgását az mRNS mentén. Példák azokra az mRNS-ekre, amelyek uORF-ei gátló peptideket kódolnak, az emlős S - adenozil-metionin-dekarboxiláz mRNS, az élesztő CPA1 mRNS, amely az arginin bioszintézis enzimet kódolja ; A humán citomegalovírus gp48 mRNS-e . Ezeknek a peptideknek a hossza 6 és 25 aminosav között mozog, és bebizonyosodott, hogy aminosavszekvenciájuk határozza meg a gátló hatást [15] .
A kódoló szekvencia uORF hatására bekövetkező transzlációjának gátlása számos transzfaktorral és környezeti feltétellel szabályozható. Például a már említett S-adenozil-metionin-dekarboxiláz mRNS transzlációját az uORF gátolja nyugvó T-sejtekben , de a transzláció sikeres a stimulált T-sejtekben és a T-vonal sejtekben; esetükben úgy tűnik, hogy a riboszómák pásztázása figyelmen kívül hagyja az uORF-et. Egy másik példa a már említett élesztő CPA1 mRNS. Az ő esetében az uORF csak arginin jelenlétében blokkolja a fő leolvasási keret transzlációját. Ennek a szabályozásnak a pontos mechanizmusát nem állapították meg, de a peptidil-transzferáz funkció gátlása az arginin hozzáadására válaszul megállítja a riboszómákat az uORF stopkodonnál. Feltételezhető, hogy az arginin vagy közvetlenül gátolja a peptidil-transzferáz aktivitását, vagy csökkenti a riboszóma A-helyének elérhetőségét [16] .
Érdekes jelenség figyelhető meg a karfiol mozaikvírus ( cauliflower mosaic virus, CaMV ) policisztronos RNS-ének transzlációja során . 5'-UTR- ja uORF - eket tartalmaz, amelyek a várakozásoknak megfelelően elnyomják a kódoló szekvencia transzlációját. Ráadásul szinte az egész 5'-UTR egy fejlett másodlagos és harmadlagos szerkezetű hajtűbe illeszkedik , ami akadályt képez a riboszóma mozgásában. Ez történik azokban a növényi sejtekben, amelyek nem gazdaszervezetei a vírusnak, és az ezek kivonataiból készített sejtmentes rendszerekben. A vírus növényi gazdaszervezeteiben azonban a transzláció megtörténik, nyilvánvalóan egy speciális sejtes faktor jelenléte és az első uORF-ek miatt. Egy részletes tanulmány feltárta, hogy amikor a CaMV RNS transzlációsan aktív, a riboszómák térbeli szerkezettel átugorják a hajtű központi részét, mintha átugrálnának rajta. Vagyis ebben az esetben söntelés megy végbe , melynek során a riboszóma beolvassa az első 3 uORF-et, miközben a hajtű alapja letekerődik, és a riboszóma olyan szerkezetű zónába kerül, hogy azonnal ki tud ugrani a helyszínről. harmadik uORF a hetedik uORF-en belüli oldalra; ezt követően a riboszóma tovább mozdul a 3'-vég felé, és megkezdi a kódoló régió fordítását [17] .
Az uORF-et érintő mutációk általában károsak, mert megzavarják a génexpressziós szabályozási rendszert, ami közvetlenül betegségekhez vezethet. Például azok a mutációk, amelyek elpusztítják az uORF-et a HR fehérjét kódoló gén 5'-UTR-jában ( angolul humán szőrtelen homológ ), az alopecia autoszomális domináns formájához vezetnek . Nem kevésbé károsak azok a mutációk, amelyek új uORF-eket hoznak létre, mivel a génexpresszió normál szabályozását is megzavarják. Felmerült, hogy a tumorszuppresszor gén mutációja a védőfehérjék expressziójának csökkenéséhez és rák kialakulásához vezethet. A protein kinázok inhibitorát kódoló CDKN2A mutációi előfeltételei lehetnek a melanoma kialakulásának . Megállapítást nyert, hogy az uORF mutációi olyan betegségek kialakulásához is vezethetnek, mint az örökletes thrombocytemia , az Alzheimer-kór , a bipoláris affektív zavar , a kardiomiopátia , az aritmogén jobb kamrai diszplázia [18] . Mindezek a példák ismét igazolják az uORF kivételes jelentőségét a génexpresszió finom szabályozásában és a homeosztázis fenntartásában , és az uORF régió variabilitása meghatározhatja az egyéni fenotípust vagy betegségekre való hajlamot [19] .