A calponin ( eng. Calponin ) az aktinkötő fehérjék családjának tagja, főként a G- és F - aktint megkötő simaizomsejtekre jellemző . A kalponinok 3 gén termékei , és az úgynevezett α-calponinra (h1 vagy bázikus, 292 a.k. , 34 kDa), β-calponinra (252 a.k.) oszlanak – amely ugyanannak a génnek a terméke, mint az α-calponin. , de a 216-256. szegmensben aminosavak deléciója van . Két másik izoforma, a semleges kalponin (h2 calponin) és a savas kalponin expresszálódik simaizom- és nem izomsejtekben. A kalponinok további képviselői az SM22 és a transzgelin. A calponin nevét a CH vagy Calponin Homology doménről kapta, amely számos ABP (aktinkötő fehérje ) között jelen van. Ennek ellenére a kalponin nem mutat aktinkötést ezen a helyen (Gimona és Mital, 1998), hanem lipideket köt (Bogatcheva és Gusev, 1995; Fujii és mtsai, 1995). Úgy gondolják, hogy az aktinkötő hely (Mezgueldi és munkatársai, 1992) a CH-domén és a kalponinszerű ismétlődések (CLIK - calponin-like repeat) közötti régióban található. A kalponin hőstabil. A simaizom izoformájának molekulatömege 34 kDa. Más szövetek savasabb kalponin izoformákat mutatnak be, amelyek nem kötik meg a kalciumot , hanem a kalmodulint . A Ca 2+ /calmodulin kötődése gátolja az aktinhoz való kötődést. A kalponin szerin-treonin kinázok általi foszforilációja hasonló hatáshoz vezet . A kalponinnak van egy tropomiozin - kötőhelye is.
A kalponin egy aktin-, kalmodulin- és tropomiozin-kötő fehérje, amely számos gerinces simaizomszövetében és egyes nem izomsejtekben is megtalálható. A vékony csirke gyomorszálak készítése során kimutatták, hogy azok aktint, tropomiozint, kaldesmont és kalponint tartalmaznak 7:0,9:0,6:0,7 mólarányban. A caldesmonhoz hasonlóan a calponin gátolja az aktomiozin ATPáz aktivitását oldatban , az aktint a foszforilált miozinhoz képest in vitro csúsztatja, és ezt a gátlást a Ca 2+ /calmodulin váltja ki . A gátlást in vitro fehérjefoszforiláció szünteti meg . Ezek a tulajdonságok arra utalnak, hogy a kalponin az aktin-miozin kölcsönhatások további szabályozója lehet.
A kalponin teljes vagy részleges kimotriptikus emésztését 25 °C-on hajtjuk végre 1:100 vagy 1:1000 proteáz / szubsztrát tömegarány alkalmazásával 10 mM imidazol - HCl , 30 mM NaCl , 2 mM MgCl2 , 4 mM oldatban. NaN3 , pH 7,0, F-aktin (4 mg/ml) hiányában vagy jelenlétében (aktin/kalponin mólarány = 3:1). Megfelelő időközönként (0-60 perc) jól meghatározott mennyiségű fehérjét keverünk össze azonos térfogatú Laemmli-féle forrásban lévő mintapufferrel, és előkészítjük a gélelektroforézishez . Térhálósítási reakciók és kötési kísérletek esetén az emésztést 2,5 mM fenil-metil-szulfonil-fluoriddal (PMSF) fejezzük be . A kalponin-aktin kovalens komplex (11 mg/ml) teljes hidrolízisét CNBr-vel (67 mg/ml két egyenlő mennyiségben) 24 órán keresztül végezzük 70%-os hangyasav -tartalmú 14 mM β-merkaptoetanolban.
Kalponin (0,7-1,3 mg/ml) 10 mM imidazol-HCl, 30 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 4 mM NaN3, pH 7,0, natív vagy szubtilizinnel hasított F-aktinnal (2,4-4,5 mg/ml) keverve ( kalponin/aktin mólarány = 1:3) 2 mM EDC és 5 mM NHS jelenlétében. A reakciót 25 °C-on 0-30 percig végeztük, és SDS gélelektroforézissel követtük nyomon. A Caldesmon (1,4 mg/ml) azonos körülmények között 1:6 fehérjemólarányt használva térhálósodik az F-aktinnal. Az F-aktin és a kalponin 22 kDa-os NH2-terminális kimotriptikus fragmentuma közötti kovalens kötést a következőképpen kapjuk meg: 60 perces kalponin kimotriptikus emésztése 1:1000 enzim/szubsztrát tömegarány mellett F-aktinnal egészítjük ki 1:3 mólarány, 180 000 x g-vel 1 órán át 4 °C-on végzett centrifugálás után a pelletet imidazol-HCl (pH 7,0) pufferben újraszuszpendáljuk. A 76 kDa-os F-aktin-kalponin adduktumnak a térhálósítatlan kalponintól való preparatív elválasztásához a 45 perces reakció után kapott térhálós F-aktin-kalponin (110 mg fehérje) oldatát 3 mM β-merkaptoetanolban dializáltuk . éjszakán át 4 °C-on depolimerizáló pufferrel szemben (50 mM Tris-HCl, 0,6 m KI, 5 mM nátrium-tioszulfát, 0,5 mM ATP , 0,5 mM CaCl2 és 0,5 mM β-merkaptoetanol, pH 7,5), majd a gélen átszűrjük. Sephacryl-S-300 (1,6 x 120 cm ) oszlop , 4 °C-on ekvilibrált ugyanabban a pufferben. A kezdeti fehérjefrakciókat gélelektroforézissel elemezve, szabad kalponint tartalmazó 76 kDa-os adduktot eluálunk. Az egyesített frakciókat desztillált vízzel dializáljuk, liofilizáljuk, és CNBr- emésztésnek vetjük alá .