Zárt nukleinsav

A lezárt nukleinsav ( LNA), más néven áthidaló  nukleinsav (BNA) [1] , és gyakran hozzáférhetetlen RNS -nek is nevezik, egy módosított RNS - nukleotid , amelyben egy ribóz-fragmentum egy további híddal módosul, amely összeköti a 2'- oxigén csoport. és 4' szén. A híd "zárja" a ribózt a 3' - endo (északi) konformációba, amely gyakran megtalálható az A-formájú duplexekben . Ez a szerkezet fokozott ellenállást biztosít az enzimes lebontással szemben [2] [3] [4] [5] . Az LNA emellett megnövelt specificitást és affinitást kínál a bázispárosításhoz, mint egy oligonukleotid monomerje vagy komponense [6] . Az LNA-nukleotidok összekeverhetők DNS- vagy RNS-maradékokkal egy oligonukleotidban.

Szintézis

Obika és munkatársai voltak az elsők, akik kémiai úton szintetizálták az LNA-t 1997-ben [7] , Jesper Wengel csoportja pedig egymástól függetlenül követte 1998-ban [8] . Ez azután vált lehetségessé, hogy Zamechnik és Stevenson 1978-ban megalapozták annak lehetőségét, hogy az oligonukleotidok kiváló szerek lehetnek a génexpresszió szabályozására [9] . A mai napig két különböző megközelítésről, amelyeket lineáris és konvergens stratégiáknak neveznek, kimutatták, hogy nagy teljesítményt és hatékonyságot biztosítanak az LNA-ban. A lineáris szintézis stratégiát először Obick és munkatársai írták le részletesen [7] Ebben a megközelítésben az uridin (vagy bármely elérhető RNS - nukleozid ) használható kiindulási anyagként . A konvergens stratégia megköveteli egy köztes cukor szintézisét, amely glikozil -donorként szolgál, és szükséges a nitrogéntartalmú bázisokhoz való kötődéshez . Jellemzően a D-glükózt intermedier cukor előállítására használják, amelyet ezt követően nitrogéntartalmú bázisokkal reagáltatnak egy módosított Vorbrügen eljárással, amely lehetővé teszi a sztereoszelektív kötést [10] .

Különböző fragmensek hozzáadása továbbra is lehetséges, miközben megőrzi a kulcsfontosságú fizikai-kémiai tulajdonságokat, mint például az eredetileg szintetizált LNA-ban megmutatkozó magas affinitást és specificitást [11] . Az ilyen oligomereket kémiai úton szintetizálják , és kereskedelmi forgalomban kaphatók.

Befoglalás a DNS-be/RNS-be

Az LNA beépülhet a DNS-be és az RNS-be bizonyos DNS- és RNS-polimerázok promiszkuitásával . A Phusion DNS polimeráz, a Pfu DNS polimerázon alapuló, kereskedelemben kifejlesztett enzim , hatékonyan építi be az LNS-t a DNS-be [12] .

Jellemzők

Az LNA nagyobb biostabilitást biztosít a biológiai nukleinsavakhoz képest . Az LNS-módosított oligonukleotidok termodinamikája javult RNS -hez , egyszálú DNS-hez és kétszálú DNS-hez hibridizálva [13] .

Alkalmazás

LNA téliek

A DNS -enzimek úgy módosíthatók, hogy magukban foglalják az LNA-maradékokat, hogy LNAzimeket (LNA-módosított DNS-enzimeket) képezzenek. Ezek a módosított oligonukleotidok, a rokon DNS-enzimekhez hasonlóan, jellemzően endonukleázok , amelyek specifikus cél-RNS-szekvenciákhoz kötődnek, és elhasítják a nukleotidok között létező foszfodiészter-kötést [14] . A foszfodiészter kötések hatékonyabb hasítását mutatják azonban módosítatlan társaikhoz képest [15] . A DNAzyme szubsztrát felismerő karjainak módosítása LNA monomerekkel olyan LNAzimet hoz létre, amely felismeri a Coxsackievirus A21 -et (CAV-21) és hasítja annak cél- RNS -szekvenciáját , hasonlóan a humán rhinovirus -14 (HRV- ) 5'-transzlálatlan régiójához (5'UTR). 14); olyan szekvencia, amelyet a módosítatlan DNS-enzimek nem ismernek fel [16] .

Terápia

Az LNA-alapú oligonukleotidok terápiás alkalmazása a biotechnológia új területe [17] . Különféle LNA-oligonukleotidokat értékeltek farmakokinetikai és toxicitási profiljuk alapján. A tanulmányok arra a következtetésre jutottak, hogy az LNA toxicitása általában független az oligonukleotid szekvenciától, és előnyös biztonsági profilt mutat a transzlálható terápiás alkalmazásokhoz [11] .

Az LNA-t terápiás tulajdonságai miatt kutatták a rák és a fertőző betegségek kezelésében. Az SPC2996 nevű blokkolt antiszensz nukleinsav-foszforotioát molekulát úgy tervezték, hogy megcélozza a Bcl-2 onkoproteint kódoló mRNS -t, egy olyan fehérjét, amely gátolja az apoptózist krónikus limfoid leukémia (CLL) sejtekben. Az I. és II. fázisú klinikai vizsgálatok a keringő CLL-sejtek dózisfüggő csökkenését mutatták ki a minta körülbelül 30%-ában, ami az SPC2996 további vizsgálatára utal [18] .

Az LNA-t a Miravirsenre is alkalmazták , a hepatitis C kísérleti terápiájára , amely egy 15 nukleotidból álló foszforotioát szekvencia, amely a MiR-122- re ( hepatocitákban expresszálódó miRNS ) kötődik [19] [20] .

Észlelés és diagnózis

Az LNA-t használó allélspecifikus PCR lehetővé teszi rövidebb primerek tervezését a kötési specifitás feláldozása nélkül [21] .

Az LNA-t beépítették a fluoreszcens in situ hibridizációba (FISH) [22] . A FISH egy gyakori technika, amelyet számos sejtben használnak genetikai anyag megjelenítésére, de a vizsgálatok kimutatták, hogy ezt a technikát korlátozza a próbák gyenge hibridizációs hatékonysága. Ezzel szemben az LNA-ba beépített próbák fokozott hibridizációs hatékonyságot mutattak mind a DNS -ben, mind az RNS -ben . Az LNA-bezárással javított FISH-teljesítmény a humán kromoszómák, számos nem humán sejttípus és microarray-ek FISH-elemzéséhez vezetett [22] .

LNA genotipizálási vizsgálatokat is végeztek, kifejezetten az apolipoprotein B mutációinak kimutatására [23] .

Az inkonzisztenciák megkülönböztetésének képessége miatt az LNA-t a diagnosztikai eszközökben való alkalmazására tanulmányozták. Immobilizált LNA-próbákat vezettek be multiplex SNP genotipizálási vizsgálatokba [24] .

Génszerkesztés

Az LNA-val módosított ssODN-ek (szintetikus egyszálú DNS-oligonukleotidok) a hagyományos ssODN-ekhez hasonlóan használhatók egybázisú gének szerkesztésére. Az LNA-nak a módosítás tervezett helyén vagy annak közelében történő használata elkerüli a DNS - hibák javítását a magasabb termodinamikai stabilitás miatt [25] .

Hivatkozások

1. ↑ Elayadi, Anissa N. (2002. augusztus). „A zárt nukleinsav-oligomerek nagy affinitású hibridizációjának hatásai a humán telomeráz gátlására †” . Biokémia _ _ ]. 41 (31): 9973-9981. DOI : 10.1021/bi025907j . ISSN  0006-2960 . PMID  12146961 .
2. ↑ Kurreck, J. (2002-05-01). „Zárolt nukleinsavakkal stabilizált antiszensz oligonukleotidok tervezése”. Nukleinsav kutatás . 30 (9): 1911-1918. DOI : 10.1093/nar/1911.9.30 . PMID  11972327 .
3. ↑ Frieden, M. (2003-11-01). „Az antiszensz oligonukleotidok tervezési horizontjának kiterjesztése alfa-L-LNA-val”. Nukleinsav kutatás _ ]. 31 (21): 6365-6372. DOI : 10.1093/nar/gkg820 . ISSN  1362-4962 . PMID  14576324 .
4. ↑ Frieden, Miriam (2003. október). „LNS-oligonukleotidok és LNA-DNS-kimérák nukleázstabilitása” . Nukleozidok , nukleotidok és nukleinsavak ]. 22 (5-8): 1041-1043. DOI : 10.1081/NCN-120022731 . ISSN 1525-7770 . PMID 14565339 .  
5. ↑ Morita, K. (2001-11-01). „2'-O, 4'-C-Etilénnel áthidalt nukleinsavak (ENA), amelyek nukleázrezisztensek és nagy affinitással rendelkeznek az RNS-hez”. Nukleinsavak szimpózium sorozat ]. 1 (1): 241-242. DOI : 10.1093/nass/1.1.241 . ISSN 0261-3166 . PMID 12836354 .  
6. ↑ Nukleinsavak orvosi kémiája . - Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, 2011. - 1 online forrás p. - ISBN 978-1-118-09280-4 , 1-118-09280-5, 978-1-118-09283-5, 1-118-09283-X 283-23990-5, 1-118-39 , 978-1-118-09281-1.
7. ↑ 1 2 Obika, Satoshi (1997-12-15). „2'-O,4'-C-metilénuridin és -citidin szintézise. Új biciklusos nukleozidok, amelyek fix C3, -endo cukor-rándulást mutatnak . Tetraéder betűk [ angol ] ]. 38 (50): 8735-8738. DOI : 10.1016/S0040-4039(97)10322-7 . ISSN  0040-4039 .
8. ↑ Orum, Miriam Frieden és Henrik (2008-03-31). „A lezárt nukleinsav ígéretes a rák kezelésében ” Jelenlegi gyógyszerészeti tervezés ]. 14 (11): 1138-1142. DOI : 10.2174/138161208784246234 . PMID 18473860 . Letöltve: 2020-10-06 . 
9. ↑ Zamecnik, PC (1978-01-01). „A Rous-szarkóma vírus replikációjának és sejttranszformációjának gátlása specifikus oligodezoxinukleotiddal”. Proceedings of the National Academy of Sciences ]. 75 (1): 280-284. Bibcode : 1978PNAS...75..280Z . DOI : 10.1073/pnas.75.1.280 . ISSN 0027-8424 . PMID 75545 .  
10. ↑ Koskin, Alekszej A. (2001-12-01). „Egyszerűsített és hatékony út a 2'-O, 4'-C-metilénnel kapcsolt biciklusos ribonukleozidokhoz (zárt nukleinsav)” . The Journal of Organic Chemistry . 66 (25): 8504-8512. doi : 10.1021/ jo010732p . ISSN 0022-3263 . PMID 11735531 .  
11. ↑ 1 2 Orum, Miriam Frieden és Henrik (2008-03-31). „A lezárt nukleinsav ígéretes a rák kezelésében ” Jelenlegi gyógyszerészeti tervezés ]. 14 (11): 1138-1142. DOI : 10.2174/138161208784246234 . PMID 18473860 . Letöltve: 2020-10-06 . Orum, Miriam Frieden és Henrik (2008-03-31). "A lezárt nukleinsav ígéretes a rák kezelésében" . Jelenlegi gyógyszerészeti tervezés . 14 (11): 1138-1142. doi : 10.2174/138161208784246234 . PMID  18473860 . Letöltve: 2020-10-06 .
12. ↑ Veedu, Rakesh N. (2007-03-26). "LNA-nukleotidok enzimatikus beépülése DNS-szálakba" . ChemBioChem [ angol ] ]. 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/ cbic.200600501 . PMID 17315250 . 
13. ↑ Veedu, Rakesh N. (2007-03-26). "LNA-nukleotidok enzimatikus beépülése DNS-szálakba" . ChemBioChem [ angol ] ]. 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/ cbic.200600501 . PMID 17315250 . Veedu, Rakesh N.; Vester, Birte; Wengel, Jesper (2007-03-26). "LNA-nukleotidok enzimatikus beépülése DNS-szálakba" . ChemBioChem . 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/cbic.200600501 . PMID  17315250 . S2CID  10206060 .
14. ↑ Breaker, R. R. (1994. december). „RNS-t hasító DNS-enzim” . Kémia és Biológia . 1 (4): 223-229. DOI : 10.1016/1074-5521(94)90014-0 . ISSN  1074-5521 . PMID  9383394 .
15. ↑ Vester, Birte (2002. november). „LNAzymes: LNA-típusú monomerek beépülése DNS enzimekbe jelentősen megnöveli az RNS hasítását” . Az American Chemical Society folyóirata ]. 124 (46): 13682-13683. DOI : 10.1021/ja0276220 . ISSN 0002-7863 . PMID 12431091 .  
16. ↑ Schubert, Steffen (2004. május). „Cél hozzáférés megszerzése a dezoxiribozimekhez.” Journal of Molecular Biology ]. 339 (2): 355-363. DOI : 10.1016/j.jmb.2004.03.064 . PMID 15136038 . 
17. ↑ "LNA: sokoldalú eszköz a terápiához és a genomikához". Trendek a biotechnológiában . 21 (2): 74-81. 2003. február. DOI : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .
18. ↑ Dürig, J. (2011. április). "Az új antiszensz Bcl-2 inhibitor SPC2996 gyors leukémiás sejttisztulást és immunaktivációt okoz krónikus limfocitás leukémiában." Leukémia [ angol ] ]. 25 (4): 638-647. DOI : 10.1038/leu.2010.322 . ISSN  1476-5551 . PMID21358717  _ _
19. ↑ Gebert, Luca F.R. (2014-01-01). "A miravirsen (SPC3649) gátolhatja a miR-122 biogenezisét." Nukleinsav kutatás . 42 (1): 609-621. doi : 10.1093/nar/ gkt852 . ISSN 0305-1048 . PMID24068553 _ _  
20. ↑ Bonneau, E. (2019-06-24). „Milyen közel állnak a miRNS-ek a klinikai gyakorlattól? Perspektíva a diagnosztikai és terápiás piacról”. EJIFCC . 30 (2): 114-127. ISSN  1650-3414 . PMID  31263388 .
21. ↑ Bonetta L (2005). „Próbaidő a valós idejű PCR-hez”. Nat. Módszerek . 2 (4): 305-312. DOI : 10.1038/nmeth0405-305 .
22. ↑ 1 2 Kubota, Kengo (2006. augusztus). „Javított in situ hibridizációs hatékonyság a zárt nukleinsavba beépített DNS-próbákkal”. Alkalmazott és környezeti mikrobiológia . 72 (8): 5311-5317. DOI : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMID  16885281 .
23. ↑ Kubota, Kengo (2006. augusztus). „Javított in situ hibridizációs hatékonyság a zárt nukleinsavba beépített DNS-próbákkal”. Alkalmazott és környezeti mikrobiológia . 72 (8): 5311-5317. DOI : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMID  16885281 .Kubota, Kengo; Ohashi, Akiyoshi; Imachi, Hiroyuki; Harada, Hideki (2006. augusztus). "Javított in situ hibridizációs hatékonyság a zárt nukleinsavba beépített DNS-próbákkal " Alkalmazott és környezeti mikrobiológia . 72 (8): 5311-5317. doi : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMC  1538721 . PMID  16885281 .
24. ↑ "LNA: sokoldalú eszköz a terápiához és a genomikához". Trendek a biotechnológiában . 21 (2): 74-81. 2003. február. DOI : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .Petersen M, Wengel J (2003. február). "LNA: sokoldalú eszköz a terápiához és a genomikához". Trendek a biotechnológiában . 21 (2):74-81. doi : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .
25. ↑ van Ravesteyn, TW (2016. április 12.). "Az egyszálú DNS-oligonukleotidok LNA-módosítása finom génmódosítást tesz lehetővé az eltérés-javításban jártas sejtekben." Az Amerikai Egyesült Államok Nemzeti Tudományos Akadémiájának közleménye . 113 (15): 4122-7. DOI : 10.1073/pnas.1513315113 . PMID  26951689 .