A polony szekvenálás ( eng. polimeráz colony - " polimeráz telep " ) egy új generációs szekvenálási (NGS ) technológia elektroforetikus elválasztás nélkül , amely lehetővé teszi több millió rövid immobilizált DNS szekvencia leolvasását , sokkal olcsóbban a Sanger szekvenáláshoz képest .
A technológiát Dr. George McDonald Church laboratóriumában fejlesztették ki a Harvardon (Harvard Medical School). Más szekvenálási technikákkal összehasonlítva a polony szekvenálás nyílt forráskódú platformon és protokollokon történik. Ennek a módszernek a hardverplatformja könnyen kombinálható a széles körben elérhető epifluoreszcens mikroszkóppal és számítógéppel vezérelt mikrofluidikai rendszerekkel.
A módszer fő gondolata nagyszámú egyedi „polónia” (polimeráz által generált molekuláris kolóniák) létrehozása, amelyeket véletlenszerű sorrendben szekvenálnak. A polon szekvenálást páros végtoldalékok ( páros végtoldalékok) könyvtárára végezzük : minden DNS-molekula 135 bp hosszúságú. ( bázispárok ), két 17-18 bp hosszú címkét tartalmaz, amelyeket egy közös szekvencia választ el egymástól és szegélyez. A jelenlegi olvasási hossza ennél a technikánál 26 bp. az amplikonhoz és a 13 p. címkéhez (minden címkén 4-5 bp-os olvasatlan hézag marad).
A polony szekvenálási protokoll három fő lépésből áll:
A protokoll a vizsgált genomiális DNS rövid (körülbelül egyenlő hosszúságú) szekvenciákra való feldarabolásával kezdődik. A kapott rövid fragmenseket végjavításnak és adeninnel történő végfeldolgozásnak vetjük alá ( adenint adunk a fragmentált DNS 3'-végéhez) . A terminális javítás a sérült vagy túlnyúló DNS-végeket 5'-foszforilált tompa végekké alakítja, ezáltal lehetővé téve az azonnali tompa végű ligálást . 6%-os TBE PAAG alkalmazásával ~1000 bp DNS-fragmenseket választunk ki. A következő lépésben a DNS-molekulákat 30 bp hosszúságú T-terminális szintetikus oligonukleotidokkal körkörös formává alakítják . (T30). A T30 két helyet tartalmaz az MmeI számára. Az így létrejövő cirkuláris DNS gördülő gyűrűs módon replikálódik . Az amplifikált cirkuláris DNS-molekulákat az MmeI restrikciós enzim ( II. típusú restrikciós endonukleáz ) dolgozza fel, amely a felismerési helyétől bizonyos távolságra vág. A restrikció eredményeként T30 fragmensek képződnek, amelyeket mindkét oldalon 17-18 bp méretű címkék szegélyeznek. mindegyik (a töredék teljes hossza így ~70 bp). A kapott, páros végcímkékkel rendelkező molekulákat meg kell javítani, mielőtt primerekkel (FDV2 és RDV2) ligálnánk a végükhöz emulziós PCR -hez (ePCR). A könyvtár komponensei 135 bp hosszúságú DNS-molekulák. méret szerint vannak kiválasztva, és nick-sugárzásnak vannak kitéve . A könyvtár felépítésének utolsó szakasza a PCR amplifikáció a könyvtári anyag mennyiségének növelése és a ligációs reakcióból származó idegen termékek eltávolítása érdekében. Az eredményül kapott DNS-templátok közé tartozik az FDV szekvencia (44 bp), a proximális címke (17-18 bp), a T30 (30 bp), a disztális címke (17-18 bp) és az RDV szekvencia (25 bp).
A végtag-könyvtár tervezésének legkritikusabb lépése a körkörös genomi DNS-molekulák kialakítása egy szintetikus linker körül. Ez a szakasz a sebességkorlátozó a teljes szakaszra.
Egyenletes méretű, sztreptavidinnel bevont paramágneses gyöngyök , amelyek biotinilezett előremenő alapozót hordoznak. A sztreptavidin nagyon erős affinitást mutat a biotinhoz, így a primer nagyon erősen kötődik a gyöngy felületéhez. A reakció vizes fázisa paramágneses gyöngyöket, PCR-komponensek keverékét, forward és reverse primereket, valamint páros végtoldalékok könyvtárát tartalmazza. A vizes fázist összekeverjük és keverjük az olajos fázissal, hogy emulziót képezzünk . Ideális helyzetben egy olajemulzióban minden csepp víz egy gyöngyöt és egy DNS-templát molekulát tartalmaz, ami lehetővé teszi milliónyi nem kölcsönható PCR amplifikációs reakció végrehajtását milliliteres térfogatban.
Az emulzió feltöréseAz amplifikáció után az előző lépésben kapott emulziót izopropanollal és detergens pufferoldattal (10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 % (v/v) Triton X-100) végzett kezeléssel megtörjük. , 1% (wt/ob) SDS), majd rázás, centrifugálás és mágneses elválasztás . A kapott oldat üres, klonális és nem klonális gyöngyöket tartalmazó szuszpenzió , amelyeket DNS-templát nélküli, egyetlen DNS-templáttal vagy több DNS-templáttal rendelkező emulziócseppekből kaptunk. A gyöngyökkel amplifikált termékekkel való dúsítás a következő lépésben történik.
A frakció dúsítása amplikonokkal ellátott golyókkalAz amplifikált termékgyöngyökkel való dúsítás nagyobb, nem mágneses , kis sűrűségű polisztirol gyöngyökkel való hibridizációval érhető el . A polisztirol gyöngyök biotinilált csali-oligonukleotidokat (az ePCR-amplifikált szekvenciákkal komplementer DNS-szekvenciákat) hordoznak. A keveréket centrifugálják, hogy a kapott komplexeket (amplikonokat tartalmazó mikrogyöngyök és csapdagyöngyök) elválasszák az amplikonokat nem hordozó mikrogyöngyöktől. A levált komplexek sűrűsége kisebb, és a felülúszóban marad , míg az amplikonok nélküli mikrogyöngyök csapadékot képeznek. A felülúszót elválasztják, és lúggal ( NaOH ) kezelik a komplexek feltörése érdekében. A paramágneses amplikon gyöngyöket mágneses elválasztással választják el a nem mágneses csapdagyöngyöktől . Ez a protokoll ötszörös dúsítást tesz lehetővé amplifikált szekvenciákat hordozó gyöngyökkel.
Lefedő léggömbökEgy záró oligonukleotid rögzítése a forward primerek 3' végéhez és a templát DNS RDV szegmenséhez. A kupak egy aminosavcsoportot tartalmaz, amely megakadályozza a fluoreszcens szonda ligálását a capped szekvenciához, ugyanakkor a kupak elősegíti a szekvencia kölcsönhatását az áramlási cella aminoszilált felületével.
Mikrochip a fedőlaponA fedőlemezeket kimossuk és aminoszilánnal kezeljük . Ez a kezelés elősegíti a kovalens kötések kialakulását a templát DNS-sel és a fluoreszcens próbák általi szennyeződés megszüntetését. Az amplikonokat tartalmazó mikrogyöngyök egy részét akrilamiddal összekeverjük és egy teflonnal bevont tárgylemezre öntjük egy kis mélyedésbe . Az akrilamid gél tárgylemezt azonnal lefedik aminoszilánnal kezelt fedőlemezzel . A polimerizációs idő 45 perc. Ezután a fedőlemezt és a tárgylemezt megfordítják, és a tárgylemezt eltávolítják. A szilánnal kezelt fedőlemez kovalensen kötődik a gélhez, míg a tárgylemez felületén lévő teflon jobb elválasztást biztosít az akrilamid géltől. Ezután a fedőlemezt az áramlási cella testéhez rögzítik, és a meg nem kötött mikrogyöngyöket eltávolítják.
A polonszekvenálás biokémiai alapja a ligázok és polimerázok megkülönböztető tulajdonságai . Először egy sor horgonyláncindítót pumpálnak át a lyukon, a primerek szintetikus oligonukleotid szekvenciákkal hibridizálódnak közvetlenül a genomi DNS disztális vagy proximális (17-18 bp hosszú) címkéinek 3' vagy 5' végén. Ezután a horgony primert fluoreszcens jelölésekkel jelölt degenerált nonameerekkel (9 nt oligonukleotidok) ligálják.
A fluoroforokat hordozó nonamerek változó sikerrel kapcsolódnak a jelzőszekvenciákhoz, degenerált primerek használatára emlékeztető módon. Azonban ahelyett, hogy a polimeráznak bemutatnák, a nonamereket szelektíven a szomszédos horgonyláncindító DNS-éhez ligáljuk. A fluoroformolekula rögzítése fluoreszcens jelet biztosít, amely lehetővé teszi az A, C, G vagy T kapcsolódás megkülönböztetését a genomi DNS-címkében a kívánt helyen. A négyszínű képek elkészítése után a horgony primerek és a nomer oligonukleotidok közötti komplexek lemosódnak, és a horgony primerek cseréje miatt új ciklus kezdődik. Bevezetik a fluoreszcensen jelölt nonamerek új keverékét, amelynél a meghatározandó pozíció 1 lépéssel eltolódik a genomi tag mentén.
Ez a technika lehetővé teszi, hogy megismerje a 7 bázis szekvenciáját az 5'-től a 3'-végig, és 6 bázist a 3'-végtől. A végeredmény egy 26 bázisból álló leolvasás (mindegyik végcímkéből 13), az egyes címkék közepén 4-5 bázisnyi hézaggal.
A címkekönyvtár befejezése körülbelül 1 hetet vesz igénybe, ha hosszú inkubációs ciklusokat végeznek egy éjszakán át. A protokoll szükség szerint leállítható a termék tisztításának bármely szakasza után. A mátrixkoncentráció titrálása az emulziós PCR-hez 2 napot vesz igénybe. Az emulziós PCR-t 2 napon belül végezzük. A szekvenálási folyamat indítása 3 órát vesz igénybe, minden következő ciklus 1,75 óra, a folyamatos szekvenálási ciklusok teljes ideje 49 óra.
A polony szekvenálás több millió 26 bázis leolvasást produkál futásonként. Ezt az információt normalizálni kell és szekvenciákká kell konvertálni. A feldolgozás a Church Lab-ban kifejlesztett szoftverrel történik. Archiválva 2005. július 17-én a Wayback Machine -nél (Church Lab). Minden szoftver nyilvános.
A polony szekvenálás lehetővé teszi DNS-szekvenciák nagy pontosságú és nagy áteresztőképességű előállítását egy széles körben elérhető olcsó eszköz segítségével. Ezen túlmenően ez a technológia nagyon rugalmas, így többféle célra is használható, beleértve a bakteriális mesterséges kromoszóma szekvenálást, a bakteriális genom reszekvenálást, valamint a sorozatos génexpressziós elemzést ( SAGE ) és a DNS vonalkód technikákat. A polony szekvenálás egyik fontos előnye az alacsony költség. A polony szekvenálási technológia széles körben elérhető fluoreszcens mikroszkóp és számítógép által vezérelt áramlási cella segítségével valósítható meg. A 2005-ös becslések szerint a szükséges felszerelés ára körülbelül 130 000 dollár. A költség azonban a közeljövőben 100 000 dollárra csökkenhet. A polony szekvenálási technológiát a Polonator nevű műszerben valósítják meg . A készülék ára 170 000 dollár. A 2005-ös számítások szerint a nyers adatok kilobázisának ára 0,11 dollár. A páros végtagok könyvtárának építési költségének figyelembe vétele nélkül az 1 kilobázis leolvasásának költsége 0,08 dollárra csökkenthető.
Bár nagy mennyiségű nyers adat van (786 gigabit), 10 000-ből csak egy bit tartalmaz hasznos információkat. Egy másik nehézség, hogy az egyenetlen erősítés csökkenti a szekvenálás hatékonyságát, és jelenleg ez a legnagyobb nehézség ennek a technológiának.
A polony szekvenálás a leghatékonyabb referencia genom jelenlétében. E. coli genom újraszekvenálására használják >99,9999%-os pontossággal és 9-szer alacsonyabb költséggel a Sanger szekvenáláshoz képest. A polony szekvenálási technológiát a SOLiD (Applied Biosystems) platform használja. PMAGE ("génexpresszió polony multiplex elemzése" - a génexpresszió többszörös elemzése polónia technológiával). A polon szekvenálást haplotipizálási és splicing vizsgálatokhoz használják .
1. Mitra, R.D., J. Shendure és mtsai. (2003). "Fluoreszcens in situ szekvenálás polimeráz telepeken." Anal Biochem. 320(1): 55-65.
2. Shendure, J., GJ Porreca és mtsai. (2005). "Egy kifejlődött bakteriális genom pontos multiplex polon szekvenálása." Science 309(5741): 1728-32.
3. Porreca, GJ, Shendure, J., Church G.M. (2006). Polony DNS szekvenálás. Curr Protoc Mol Biol: 7. fejezet: 7.8. egység.
4. Lin B., Wang J., Cheng Y. (2008). "Legutóbbi szabadalmak és a következő generációs szekvenálási technológiák fejlődése." Legutóbbi Pat Biomed Eng: (1):60-67.