Fluoreszcencia anizotrópia

A fluoreszcencia anizotrópia ( fluoreszcens polarizáció)  egy fizikai jelenség, amely a fluoroforok által kibocsátott fény különböző intenzitásából áll a különböző polarizációs tengelyek mentén. A kutatás úttörői ezen a tudományterületen Alexander Yablonsky , Gregorio Weber [1] és Andreas Albrecht [2] voltak . A fluoreszcencia polarizáció elemzésén alapuló módszereket széles körben alkalmazzák a fehérjékkel kölcsönhatásba lépőkis molekulatömegű vegyületek szűrésében és a fehérjék szerkezetének vizsgálatában.

Módszer elve

A fluoreszcencia jelensége azon alapul, hogy egy molekula foton abszorpciója hatására gerjesztett állapotba kerül . Rövid késleltetés (a karakterisztikus fluoreszcencia idő τ ) után a molekula visszatér alapállapotába , hő formájában leadja az energia egy részét, és újabb fotont bocsát ki. Ezen események során a molekula elektronjai újra eloszlanak. Ebben a tekintetben a fotonnal történő gerjesztés csak a fény elektromos térvektorának a molekulához viszonyított bizonyos orientációjával lehetséges, és a kibocsátott foton bizonyos módon polarizálódik a molekulához képest.

Ha a fluoroforok egy csoportját polarizált fénnyel világítjuk meg, akkor a polarizációs síkhoz képest bizonyos szögtartományban elhelyezkedő molekulák gerjesztett állapotba kerülnek. Ha álló helyzetben vannak, a kibocsátott fény is polarizálódik egy bizonyos szögben. Ezt a belső anizotrópiát ( r 0 ) általában úgy mérik, hogy fluoroforokat építenek be egy fagyasztott többértékű alkoholba .

A kibocsátott fény polarizációs foka csökkenthető, ha a fluoroforok szabadon foroghatnak. Az elnyelt és kibocsátott fény polarizációja közötti korreláció csökkenésének mértéke a ϕ fluorofor térbeli orientációjában bekövetkezett változás karakterisztikus idejének és a τ karakterisztikus fluoreszcenciaidő arányától függ . A fluorofor orientációjának változásának oka lehet a teljes molekula, vagy csak a fluorofort tartalmazó fragmensének forgása. Az anizotrópia mértéke a következő összefüggéssel kapcsolódik a forgási sebességhez:

,

ahol r  a megfigyelt anizotrópia, r0 a molekula belső  anizotrópiája, τ  a jellemző fluoreszcenciaidő és ϕ  a jellemző forgási idő.

Ez az érvelés csak akkor alkalmazható, ha a fluoroforok elég messze vannak egymástól. Ha a közelben vannak, a Förster-rezonancia ( eng.  FRET ) hatására energiát cserélhetnek , ami a megfigyelt anizotrópia csökkenéséhez vagy a korreláció erősebb csökkenéséhez vezet. A FRET ezen megvalósítását emFRET-nek (energiamigrációs FRET) nevezik.

Alkalmazás

A fluoreszcens anizotrópia felhasználható kötési állandók meghatározására , vagy a molekulák forgási idejének változásával kísért reakciók kinetikájának tanulmányozására. Például, ha egy fluorofor egy kis molekulához kapcsolódik, akkor annak forgási sebessége jelentősen lecsökkenhet, amikor egy fehérjéhez kötődik. Ha a fluorofor nagyobb molekulához kapcsolódik, akkor a szabad és a kötött állapot közötti polarizációs különbség kisebb lesz (többek között a nagy molekula kezdetben alacsony forgási sebessége miatt), ami a mérési pontosság csökkenéséhez vezet. A kötődés mértékét a szabad, részlegesen kötött és teljesen kötött (fehérjefeleslegben) állapotok közötti anizotrópia változása határozza meg titrálással .

Ha a fluorofor egy nagy molekulához, például egy fehérjéhez vagy RNS -hez kapcsolódik, mobilitásában a hajtogatás során bekövetkezett változása felhasználható a hajtogatás dinamikájának tanulmányozására.

Mikroszkópiában a fluoreszcencia polarizáció jelensége alkalmazható a citoszol vagy membránok lokális viszkozitásának vizsgálatára, a membránok lokális mikroszerkezetének vagy lipidösszetételének meghatározására . Ez a fényforrás után és a kamera előtt elhelyezett polarizátorokat használ. Ezzel a technikával a molekulák kölcsönhatásait is lehet vizsgálni jelkaszkádokban különböző hatásokra válaszul.

Az emFRET jelenség és az ezzel járó anizotrópia csökkenés jól használható a aggregáció vizsgálatában .

Jegyzetek

  1. ↑ Weber, G., 1953. Rotációs Brown-mozgás és oldatok fluoreszcenciájának polarizációja. Adv. fehérje kém. 8:415-459
  2. ↑ Albrecht, A., 1961. Polarizációk és átmenetek hozzárendelése: a fotoszelekció módszere. J. Mol. Spectrosc. 6:84-108.

Irodalom