Valós idejű polimeráz láncreakció

A valós idejű polimeráz láncreakció (vagy kvantitatív PCR, qPCR, PCR-RT, eng.  Real-time PCR, qPCR ) a polimeráz láncreakció módszerén alapuló laboratóriumi módszer , amely lehetővé teszi nemcsak a cél nukleotid jelenlétének meghatározását. sorozatot a mintában, hanem mérje meg a másolatok számát is. Az amplifikált DNS mennyiségét minden egyes amplifikációs ciklus után mérjük fluoreszcens jelölésekkel: próbákkal vagy interkalátorokkal . Az értékelés lehet kvantitatív (a templát példányszámának mérése) és relatív (a bevitt DNS-hez vagy további kalibrációs génekhez viszonyított mérés ) [1] .

A módosított kvantitatív PCR-módszert félkvantitatív PCR- nek (semi-quantitative PCR) nevezik . Gyakran használják több gén expressziójának összehasonlítására. Ebben az esetben a felhalmozódott termék mennyiségét csak egy ponton mérik - a reakció leállása után. [2]

A valós idejű PCR-t gyakran kombinálják más módszerekkel: RT-PCR ( RT-qPCR ) , ChIP - qPCR stb. [3]

A módszer leírása

A qPCR-eljárás hasonló a klasszikus PCR -eljáráshoz , vagyis a reakció minden szakasza jelen van - a kétszálú DNS megolvadása 95 ˚C-on, a primerek összekapcsolása (az összekapcsolási hőmérséklet a használt primerektől függ) és az elongáció Taq polimeráz használata esetén 72 ˚C hőmérséklet . A PCR-termék mennyiségét minden PCR-ciklusban mérjük fluoreszcens jelölések segítségével. Így a jel erőssége a kérdéses molekula kezdeti mennyiségét jelzi [4] .

Erősítési diagram

A qPCR-hez általában használt nómenklatúra a következő:

  1. Az alapértékek olyan PCR-ciklusok, amelyekben a fluoreszcens jel a műszer által érzékelhető érték alatt van.
  2. ΔRn a fluoreszcens jel növekedése minden egyes időpillanatban.
  3. A küszöbvonal a fluoreszcencia tetszőleges szintje, amelyet az alapvonal alapján választanak ki. A küszöbérték felett észlelt jelet valós jelnek tekintjük, amely felhasználható a minta küszöbciklusának (Ct) meghatározására. A küszöbérték minden kísérletnél beállítható úgy, hogy az összes parcellán az exponenciális tartományban legyen.
  4. A ciklusok küszöbértéke (Ct) azon PCR-ciklusok száma, amelyeknél a fluoreszcencia meghaladja a küszöbértéket.

A grafikon egy alapvonalból, egy exponenciális fázisból és egy platóból áll [5] .

A kezdeti szakaszban a fluoreszcencia gyenge, mivel kevés a termék, ezért nehéz megkülönböztetni a háttértől. Ahogy a szorzat felhalmozódik, a jel először exponenciálisan növekszik , majd elér egy platót. A plató a reakció egyik vagy másik komponensének hiánya miatt következik be - primerek , nukleotid-trifoszfátok , kifogyhat egy fluoreszcens jelölés. Ha túl sok reakciótermék halmozódik fel, akkor a polimeráz korlátozó tényezővé válhat , és ekkor a termék mennyiségének a ciklustól való függése lineárissá válik . Érdemes megjegyezni, hogy egy standard valós idejű PCR-reakcióban minden minta platóba kerül, és megközelítőleg azonos jelszintet ér el. Így a végpont nem mond semmit a vizsgálati minta kezdeti mennyiségéről. Másrészt az exponenciális fázisban a termékmennyiség növekedési ütemében különbségek nyomon követhetők. A molekulák kezdeti számában mutatkozó különbségek befolyásolják a fluoreszcenciaszintnek a zajszint fölé emeléséhez szükséges ciklusok számát [5] .

A Ct egy olyan szám, amely felhasználható az oldatban lévő cél DNS mennyiségének megítélésére, de a Ct érték számos véletlenszerű tényezőtől függhet, mint például a detektor érzékenysége , a szűrő minősége stb. Ezért a kérdéses termék pontos kezdeti mennyisége nem mérhető. Vannak normalizálási módszerek a probléma megoldására . Mérje meg a mintában lévő két molekula mennyiségének arányát! Általában a háztartási  gének termékeire normalizálják őket - gének, amelyek száma egy sejtben mindig megközelítőleg azonos (például az infA gén, amely a baktériumokban a transzlációs iniciációs faktort kódolja ) . Az arányt a következő képlet határozza meg:

ahol és  a két minta kezdeti mennyiségei, a Ct B és a Ct A  a megfelelő Ct-értékek, és  a PCR hatékonysága, amelyet gyakran vagy [5] -nek neveznek .

Olvadási görbe elemzés

A valós idejű PCR lehetővé teszi a specifikus amplifikált DNS-fragmensek azonosítását olvadási (denaturációs) hőmérsékletük elemzésével, amelyet Tm-értéknek is neveznek. A módszer interkaláló festékeket használ, általában SYBR Greent . A DNS olvadáspontja az amplifikált fragmensre jellemző. Ennek a módszernek az eredményeit az elemzett DNS-minták disszociációs görbéinek összehasonlításával kaptuk. Az elemzéshez két olvadási görbét ábrázolunk. Az első a fluoreszcencia időfüggősége, a második a fluoreszcencia időbeli esésének sebessége. A csúcs egy specifikus DNS-mintázatot tükröz [5] .

A használt fluoroforok osztályozása

Nem specifikus definíció: kvantitatív PCR kétszálú DNS - kötő festékekkel, mint riporterekkel

Ebben az esetben a címke egy kémiai vegyület , amely képes beépülni a DNS kettős hélixbe . Az ilyen próba megváltoztatja a konformációját a PCR-termékekkel való kölcsönhatás során, és fluoroforrá válik . A termék meghatározása minden ciklus végén, a denaturálási lépés előtt elvégezhető . Ilyen festék például a széles körben használt SYBR Green. A kétszálú DNS (dsDNS) festékek azonban az összes dsDNS-hez kötődnek, beleértve a nem specifikus PCR-termékeket is (például a primer dimert ). Ez potenciálisan megzavarhatja a célszekvencia monitorozás pontosságát [6] .

Specifikus definíció: fluoreszcens riporter szonda

A fluoreszcens próbák csak a próbával komplementer DNS-tartalmú szekvenciát mutatják ki ; ezért a riporter szonda használata nagymértékben növeli a specificitást és pontosabb mérést tesz lehetővé más dsDNS jelenlétében . A fluoreszcens riporter próbák azonban nem akadályozzák meg a primer dimerek gátló hatását, amelyek elnyomhatják a cél reakciótermékek felhalmozódását [7] .

Több olyan szonda is használható, amelyek fluoroforjai eltérő emissziós spektrummal rendelkeznek . Ebben az esetben lehetővé válik a különböző DNS-molekulákból származó jel regisztrálása egy csőben. A módszer neve többszörös PCR (eng. multiplex PCR ) [8] .

A módszer az amplifikációs termékkel komplementer DNS-próba bevezetésén alapul, a próba egyik végén fluoreszcens riporterrel és a másik végén fluoreszcens kioltóval. Amikor a kioltó a riporter közvetlen közelében van, elnyeli a jelet, és a riporter nem fluoreszkál . Az amplifikáció során a szonda integritása megszakad, és a riporter fluoreszcenciával detektálható lézeres gerjesztést követően. Ezért a termék mennyiségének növelése, amelyhez a riporter próba minden PCR ciklusban kötődik, a fluoreszcencia arányos növekedését okozza . A címkék fluoreszkálhatnak az elongációs fázisban vagy a PCR annealing fázisban [4] .

A szondára 5' és 3' végéről egy fluorofort és annak kioltóját varrják fel. Ha a próbaszekvencia nem túl hosszú, akkor még DNS-hez kötött állapotban is kölcsönhatásba lépnek egymással, és nem bocsátanak ki fluoreszcenciát. Az elongáció során a DNS-polimeráz , amely 5'-3'-exonukleáz aktivitással rendelkezik (gyakran használják Taq-polimeráz ), egy nukleotidonként disszociálja a próbát a cél DNS -től. A folyamat eredményeként mind a fluorofor, mind a kioltója bekerül az oldatba, ahol kicsi a valószínűsége, hogy a közelben találják ezeket az anyagokat, és helyreáll a fluoreszcencia [4] .

  1. A fluorogén hajtű  egy kis egyszálú DNS-molekula, amely szabad állapotában képes a DNS speciális térbeli szerkezetét - hajtűt - kialakítani . A lánc egyik végére egy fluorofort, a másikra pedig egy azt kioltó anyagot varrnak. A próbaszekvencia komplementer a cél DNS-sel. Ebben az esetben az oldatban lebegő próbamolekulák nem adnak fluoreszcens jelet, a DNS- molekulákhoz kötöttek pedig konformációs változásokon mennek keresztül , ami a fluorofor és kioltója térbeli szétválását és a fluoreszcencia helyreállítását eredményezi. A regisztrációt a denaturálás után célszerű elvégezni [4] .
  2. A FRET módszeren alapuló címke . Ennek a módszernek az alapja két próba jelenléte, amelyek egymástól kis távolságra kötődnek a cél DNS-hez. Egy fluorofor donort és egy fluorofor akceptort varrunk az egyik próba 5' végére, illetve a második próba 3' végére. Amikor közel vannak egymáshoz, a donor fluorofor egy bizonyos hullámhosszú fényt nyel el, és hosszabb hullámhosszú spektrumban világít . Ezt a hullámot pedig elnyeli az akceptor fluorofor, és kibocsátja a regisztrált fényt. [4] .

Alkalmazás

A valós idejű PCR-t széles körben használják számos laboratóriumi kutatási alkalmazásban. Ezenkívül ezt a módszert az orvostudományban (betegségek diagnosztizálására) és a biotechnológia területén (élelmiszerek és növényi anyagok mikroorganizmus - tartalmának meghatározására ; GMO -k kimutatására ) alkalmazták. A qPCR-t vírusok és más humán kórokozók genotipizálására és mennyiségi meghatározására is használják .

Tudományos kutatás

A génexpresszió mennyiségi meghatározása

A qPCR-t a géntranszkripció kvantitatív mérésének egyik módszereként használják . Ezt a módszert széles körben használják egy adott gén expressziójában az idő múlásával bekövetkező változások értékelésére , például egy gyógyszer beadására vagy a környezeti feltételek változásaira adott válaszként. A génexpresszió számszerűsítése hagyományos DNS-detektáló módszerekkel megbízhatatlan. Az mRNS kimutatása Northern-blottal , gél -PCR-termékekkel vagy Southern-blottal nem teszi lehetővé a pontos mennyiségi meghatározást. Például egy tipikus PCR 20-40 ciklusán belül a DNS-termék mennyisége elér egy olyan platót, amely nincs közvetlenül összefüggésben a kezdeti PCR-ben szereplő cél- DNS mennyiségével [9] .

A valós idejű PCR két általánosan elterjedt módszerrel használható a nukleinsavak mennyiségi meghatározására: a relatív kvantifikációval és az abszolút kvantifikációval [10] . Az abszolút mennyiségi meghatározás megadja a cél - DNS - molekulák pontos számát egy standard görbe segítségével . Ezért fontos, hogy a minta és a standard PCR-je azonos amplifikációs hatékonysággal rendelkezzen . A relatív pontozás belső referenciagéneken ( háztartási gének ) alapul, hogy meghatározzák a célgén-expresszió közötti különbségeket. A mennyiségi meghatározást a komplementer DNS - ként értelmezett mRNS expressziós szintjének változásában fejezzük ki ( mRNS reverz transzkripcióval előállított cDNS ). A relatív kvantifikációt könnyebb elvégezni, mert nincs szükség kalibrációs görbére, mivel a vizsgált gén mennyiségét összehasonlítják a kontrollgén mennyiségével [11] .

qPCR a kis nukleáris RNS (snRNS) mennyiségének meghatározásához

A kis nukleáris RNS -ek (snRNS-ek) tulajdonságaikban nagyon rövid hosszúságban különböznek az mRNS-ektől (körülbelül 22 nukleotid ), nincs konzervatív szekvenciájuk a végén, míg egy populáció snRNS-ei egy vagy több nukleotiddal eltérhetnek . Ezeknek a problémáknak a megoldására olyan megközelítéseket alkalmaznak, amelyek egy kis DNS -darab (linker) cDNS -hez való hozzáadására épülnek reverz transzkripciós reakcióban . Ezután a valós idejű PCR-t standard módszerekkel hajtják végre, primerekkel, (biológia)|komplementerek a linkerrel [12] .

Genomikai vizsgálatok ChIP-qPCR segítségével

A kromatin immunprecipitációt (ChIP) az RT-qPCR- rel kombinálva a genomikai kutatások alapvető módszerének tekintik, kereskedelmi elérhetősége és nagy pontossága lehetővé teszi a fehérje-DNS kölcsönhatások gyors és egyszerű elemzését. A ChIP-qPCR-t specifikus gének és potenciális szabályozó régiók, például promóterek vizsgálatára használják . Ezt a módszert jelenleg különféle tanulmányokban alkalmazzák, beleértve a sejtdifferenciálódást , a szuppresszorgén -csendesítést és a hisztonmódosítások hatását a génexpresszióra [13] .

A ChIP analízis a genomban jelenlévő lehetséges célpontoknak csak egy töredékét ragadja meg a keresztkötések hatékonyságának változatossága és az antitestek elérhetőségének térbeli korlátozása miatt [13] .

A ChIP-qPCR végrehajtásához hozzá kell adni a master mixet ( enzimek és nukleotidok keverékét ), a primereket és a templát DNS-t. Ebben az esetben pontosan meg kell választani a primerek koncentrációját a cél-DNS hatékony amplifikációjához. Vagy a ChIP DNS szolgál templátként, vagy negatív kontroll esetén üres gyöngyök DNS nélkül. Ezután meg kell választani a lágyítási ciklusok idejét és hőmérsékletét, és elindítani a PCR-t. Az eredményeket a qPCR eredményekhez hasonlóan elemezzük, összehasonlítva a bemeneti templát és a ChIP DNS templát ciklusszámának küszöbértékét (Ct) [3] .

Orvosi diagnosztika

A kvantitatív PCR-t olyan gének vagy DNS-fragmensek gyors azonosítására használják, amelyek fertőző betegségek , genetikai rendellenességek stb. markerei. Ennek a módszernek a klinikai laboratóriumokban történő bevezetése jelentősen javította a fertőző betegségek diagnosztizálásának minőségét [14] . Ezenkívül a qPCR-t eszközként használják az újonnan megjelenő betegségek kimutatására. Például az influenza új törzsei [15] .

A qPCR használata lehetővé teszi a vírusok , például a hepatitis B vírus kvantitatív mérését és genotipizálását (a törzsek jellemzését) is [16] . Nagy jelentősége van a fertőzés mértékének , amelyet a vírusgenom kópiáinak számában mérnek a beteg szövetegységére vonatkoztatva . Például az 1-es típusú herpes simplex vírus újraaktiválódásának valószínűsége a fertőzött ganglionok számától függ [17] .

A koronavírus-fertőzés gyanújával rendelkező betegeknél torokmintát vesznek, RNS -t extrahálnak, és RT-qPCR-rel elemzik . A célgének a nyitott leolvasási keret 1ab (ORF1ab) és a nukleokapszid fehérje (N). A 37-nél kisebb ciklusküszöböt (Ct-értéket) pozitív vizsgálati eredményként, a 40-es vagy annál nagyobb Ct-értéket negatív vizsgálati eredményként határozzák meg. Ezek a diagnosztikai kritériumok az Országos Vírusbetegségek Ellenőrzési és Megelőzési Intézet ajánlásain alapulnak [18] .

Az RT-qPCR teszt érzékenysége 83,3%, ez a teszt hajlamos hamis negatív eredményekre . Számítógépes tomográfiát is használnak a koronavírus diagnosztizálására , amelynek érzékenysége sokkal magasabb, és eléri a 97,2%-ot [19] .

A kvantitatív PCR-t széles körben alkalmazzák a tumorsejtek kimutatására szolid tumorokban [20] [21] és még a leukémia egyes formáiban is [22] [23] .

A qPCR segít a keringő daganatsejtek kimutatásában . Például a mellrák még mindig a leggyakoribb halálok a rákos betegek körében. Ezenkívül a halált gyakran a keletkezett áttétek okozzák . A metasztázisok annak eredményeként alakulnak ki, hogy a szaporodásra képes sejtek elválik a daganattól , bejutnak a véráramba és újra megtelepednek a test valamely részében. Ezeket a sejteket keringő őssejteknek (CSC-k) nevezik. Az ilyen sejtek jelenléte az emlőrákos betegek vérében általában a terápia kimenetelének és általában a túlélésnek rossz prognózisával jár, ezért nagyon fontos diagnosztikai paraméter. De a nagyon alacsony szám miatt a CVT azonosítása  nehéz feladat.

A qPCR mint rendkívül érzékeny módszer pedig ennek a problémának a megoldására használható. A CST - k epiteliális eredetűek, és ezért egy bizonyos génkészletet fejeznek ki, amely különbözik az őket körülvevő vérsejtektől , amelyek mezenchimális eredetűek. A módszer alkalmazásához meg kell határozni a CST marker gének készletét és értékelni kell expressziós szintjét [24] .

A mikrobiológiában

A valós idejű PCR-t mikrobiológiai munkára is használják az élelmiszerbiztonság területén, a víz (ivóvíz és szennyvíz) minőségének felmérésére, valamint a közegészségügy területén [25] . Ezenkívül ezt a módszert a bél mikroflóra azonosítására használják [26] .

Fitopatogének kimutatása

Az agráripar a gazdasági veszteségek megelőzése és a termékek eltarthatóságának növelése érdekében kórokozómentes magvakat és palántákat állít elő. Ezért olyan rendszereket fejlesztettek ki, amelyek kis mennyiségű fitoftórát ( Phytophthora ramorum ), oomycetet és néhány más kórokozót képesek kimutatni, amelyek elpusztítják a tölgyeket és más növényfajokat a gazdanövény DNS-ével keverve. A kórokozó és a gazdanövény DNS-e megkülönböztetésének képessége az egyes taxonokra jellemző ITS ( internal transcribed spacer) szekvenciák, a riboszomális RNS gén kódoló régiójában található belső átíródó régiók amplifikációján alapul [27]. ] .

A genetikailag módosított szervezetek azonosítása

A qPCR ( fordított transzkripciót használva ) felhasználható genetikailag módosított szervezetek kimutatására , mivel érzékenyebb, mint sok más módszer. Ebben az esetben specifikus primereket használnak a vektor létrehozási folyamatában használt promoter, terminátor vagy intermedier szekvenciák amplifikálására . Mivel a transzgénikus növény létrehozásának folyamata általában a transzgén egynél több másolatának beépítését eredményezi , mennyiségét általában qPCR segítségével becsülik meg. Ebben az esetben ezt a gént egyetlen példányban tartalmazó növényt használjuk kontrollként [28] [29] .

Jegyzetek

  1. ↑ VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM Huszonöt év kvantitatív PCR a génexpressziós  elemzéshez //  Biotechniques : folyóirat. - 2008. - Vol. 44 . - P. 619-626 . - doi : 10.2144/000112776 . — PMID 18474036 .
  2. ↑ Selma Gouvêa-Barros, Maria do Carmo Bittencourt-Oliveira. Szemi-kvantitatív PCR a hepatotoxikus cianobaktériumok mennyiségi meghatározásához  // Journal of Environmental Protection. - 2012. - T. 03 , sz. 05 . — S. 426–430 . — ISSN 2152-2219 2152-2197, 2152-2219 . - doi : 10.4236/jep.2012.35053 .
  3. ↑ 1 2 Tae Hoon Kim, Job Dekker. ChIP – Kvantitatív polimeráz láncreakció (ChIP-qPCR)  (angol)  // Cold Spring Harbor Protocols. — 2018-05. — Vol. 2018 , sz. 5 . - P.pdb.prot082628 . - ISSN 1559-6095 1940-3402, 1559-6095 . - doi : 10.1101/pdb.prot082628 .
  4. ↑ 1 2 3 4 5 Provenzano M. , Mocellin S. Komplementer technikák: génexpressziós adatok validálása kvantitatív valós idejű PCR-rel.  (angol)  // Előrelépések a kísérleti orvostudományban és a biológiában. - 2007. - Vol. 593 . - 66-73 . o . - doi : 10.1007/978-0-387-39978-2_7 . — PMID 17265717 .
  5. ↑ 1 2 3 4 Kubista M. , Andrade JM , Bengtsson M. , Forootan A. , Jonák J. , Lind K. , Sindelka R. , Sjöback R. , Sjögreen B. , Strömbom L. , Ståhlberg A. , Zoric N A valós idejű polimeráz láncreakció.  (angol)  // Az orvostudomány molekuláris vonatkozásai. - 2006. - április ( 27. évf. , 2-3. sz. ). - P. 95-125 . - doi : 10.1016/j.mam.2005.12.007 . — PMID 16460794 .
  6. ↑ Xiujuan Peng, Alex Nguyen, Debadyuti Ghosh. M13 és T7 bakteriofágok mennyiségi meghatározása TaqMan és SYBR zöld qPCR segítségével  (angol)  // Journal of Virological Methods. — 2018-02. — Vol. 252 . — P. 100–107 . — ISSN 0166-0934 . - doi : 10.1016/j.jviromet.2017.11.012 .
  7. ↑ E. Navarro, G. Serrano-Heras, M. J. Castaño, J. Solera. Valós idejű PCR detektálási kémia  (angol)  // Clinica Chimica Acta. — 2015-01. — Vol. 439 . — P. 231–250 . - doi : 10.1016/j.cca.2014.10.017 . Archiválva : 2020. május 1.
  8. ↑ Steve F. C. Hawkins, Paul C. Vendég. Multiplex elemzések valós idejű kvantitatív PCR használatával  //  Multiplex biomarker technikák. — New York, NY: Springer New York, 2016. 11. 29. — P. 125–133 . - ISBN 978-1-4939-6729-2 , 978-1-4939-6730-8 .
  9. ↑ L. Overbergh, A. Giulietti, D. Valckx, R. Decallonne, R. Bouillon. A valós idejű reverz transzkriptáz PCR használata a citokin génexpresszió kvantitatív meghatározásához  // Journal of biomolecular techniques: JBT. — 2003-03. - T. 14 , sz. 1 . – 33–43 . — ISSN 1524-0215 . Archiválva az eredetiből 2016. április 29-én.
  10. ↑ S. Dhanasekaran, T. Mark Doherty, John Kenneth, TB Trials Study Group. Különböző szabványok összehasonlítása a valós idejű PCR-alapú abszolút kvantifikációhoz  // Journal of Immunological Methods. — 2010-03-31. - T. 354 , sz. 1-2 . – 34–39 . — ISSN 1872-7905 . - doi : 10.1016/j.jim.2010.01.004 . Archiválva az eredetiből 2019. március 2-án.
  11. ↑ Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). Valós idejű PCR kézikönyv / Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). — Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). - 2014. - S. 40-43. — 68 s.
  12. ↑ Benes V. , Castoldi M. MikroRNS expressziós profilozása valós idejű kvantitatív PCR segítségével, felhasználási módja és elérhetőségei.  (angol)  // Módszerek (San Diego, Kalifornia). - 2010. - április ( 50. évf. , 4. sz.). - P. 244-249 . - doi : 10.1016/j.ymeth.2010.01.026 . — PMID 20109550 .
  13. ↑ 12 Patrik Asp. Hogyan kombináljuk a ChIP-t qPCR-rel  //  Chromatin Immunoprecipitation / Neus Visa, Antonio Jordán-Pla. - New York, NY: Springer New York, 2018. - Vol. 1689 . — P. 29–42 . - ISBN 978-1-4939-7379-8 , 978-1-4939-7380-4 . - doi : 10.1007/978-1-4939-7380-4_3 .
  14. ↑ Sails AD (2009). Alkalmazások a klinikai mikrobiológiában. Valós idejű PCR: jelenlegi technológia és alkalmazások . Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4
  15. ↑ Az FDA engedélyezi az influenza elleni gyógyszerek sürgősségi alkalmazását, diagnosztikai tesztet a sertésinfluenza emberekben történő kitörése esetén. FDA News, 2009. április 27.
  16. ↑ Yeh SH , Tsai CY , Kao JH , Liu CJ , Kuo TJ , Lin MW , Huang WL , Lu SF , Jih J. , Chen DS , Chen PJ Hepatitis B vírus mennyiségi meghatározása és genotipizálása egyetlen reakcióban valós idejű PCR segítségével és olvadási görbe elemzése.  (angol)  // Journal of Hepatology. - 2004. - október ( 41. évf. , 4. sz.). - P. 659-666 . - doi : 10.1016/j.jhep.2004.06.031 . — PMID 15464248 .
  17. ↑ Sawtell NM Az 1-es típusú herpes simplex vírus in vivo reaktiválódásának valószínűsége nő a látensen fertőzött neuronok számával a ganglionokban.  (angol)  // Journal Of Virology. - 1998. - augusztus ( 72. évf. , 8. sz.). - P. 6888-6892 . — PMID 9658140 .
  18. ↑ Dawei Wang, Bo Hu, Chang Hu, Fangfang Zhu, Xing Liu. 138, 2019-ben új, koronavírussal fertőzött tüdőgyulladásban szenvedő kórházi beteg klinikai jellemzői Vuhanban, Kínában   // JAMA . – 2020-03-17. — Vol. 323 , iss. 11 . - 1061. o . — ISSN 0098-7484 . doi : 10.1001 / jama.2020.1585 . Archiválva : 2020. április 1.
  19. ↑ Chunqin Long, Huaxiang Xu, Qinglin Shen, Xianghai Zhang, Bing Fan. A koronavírus-betegség (COVID-19) diagnózisa: rRT-PCR vagy CT?  (angol)  // European Journal of Radiology. – 2020-05. — Vol. 126 . — P. 108961 . doi : 10.1016 / j.ejrad.2020.108961 . Archiválva : 2020. május 14.
  20. ↑ Cen P. , Ni X. , Yang J. , Graham DY , Li M. Keringő tumorsejtek a hasnyálmirigyrák diagnosztizálásában és kezelésében.  (angol)  // Biochimica Et Biophysica Acta. - 2012. - December ( 1826. évf . , 2. sz.). - P. 350-356 . - doi : 10.1016/j.bbcan.2012.05.007 . — PMID 22683404 .
  21. ↑ Young R. , Pailler E. , Billiot F. , Drusch F. , Barthelemy A. , Oulhen M. , Besse B. , Soria JC , Farace F. , Vielh P. Keringő tumorsejtek tüdőrákban.  (angol)  // Acta Cytologica. - 2012. - Kt. 56 , sz. 6 . - P. 655-660 . - doi : 10.1159/000345182 . — PMID 23207444 .
  22. ↑ Brüggemann M. , Gökbuget N. , Kneba M. Acute lymphoblastic leukemia: monitoring minimal reziduális betegség, mint terápiás elv.  (angol)  // Seminars In Oncology. - 2012. - február ( 39. évf. , 1. sz.). - P. 47-57 . - doi : 10.1053/j.seminoncol.2011.11.009 . — PMID 22289491 .
  23. ↑ DiNardo CD , Luger SM A morfológián túl: minimális reziduális betegség kimutatás akut myeloid leukémiában.  (angol)  // Current Opinion In Hematology. - 2012. - március ( 19. évf. , 2. sz.). - 82-88 . o . - doi : 10.1097/MOH.0b013e3283501325 . — PMID 22314322 .
  24. ↑ Andergassen U. , Kölbl AC , Hutter S. , Friese K. , Jeschke U. Keringő daganatsejtek kimutatása emlőrákos betegek véréből RT-qPCR segítségével.  (angol)  // Rák. - 2013. - szeptember 25. ( 5. köt. , 4. sz.). - P. 1212-1220 . - doi : 10.3390/rákok5041212 . — PMID 24202442 .
  25. ↑ Filion, M (szerkesztő) (2012). Kvantitatív valós idejű PCR az alkalmazott mikrobiológiában Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0 .
  26. ↑ Nobre Giselle , S. Miglioranz Lucia Helena. Probiotikumok: Az emberi egészségre gyakorolt ​​hatás és a jelenlegi kilátások   // Probiotikumok . - 2012. - október 3. — ISBN 9789535107767 . - doi : 10.5772/50048 .
  27. ↑ Baldwin BG A nukleáris riboszomális DNS belső átírt távtartóinak filogenetikai hasznossága növényekben: példa a kompozitokból.  (angol)  // Molekuláris filogenetika és evolúció. - 1992. - március ( 1. köt. 1. sz . ). - P. 3-16 . — PMID 1342921 .
  28. ↑ Holst-Jensen A. , Rønning SB , Løvseth A. , Berdal KG PCR technológia genetikailag módosított szervezetek (GMO-k) szűrésére és mennyiségi meghatározására.  (angol)  // Analitikai és bioanalitikai kémia. - 2003. - április ( 375. évf. , 8. sz.). - P. 985-993 . - doi : 10.1007/s00216-003-1767-7 . — PMID 12733008 .
  29. ↑ Brodmann PD , Ilg EC , Berthoud H. , Herrmann A. Valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakciós módszerek négy genetikailag módosított kukoricafajtára és a kukorica DNS-tartalmára az élelmiszerekben.  (angol)  // Journal Of AOAC International. - 2002. - május ( 85. évf. , 3. sz.). - P. 646-653 . — PMID 12083257 .

Irodalom

  • Glick B., Pasternak J. Molekuláris biotechnológia. Alapelvek és alkalmazás. - Moszkva: Mir, 2002. - 589 p. — ISBN 5030033289 .