Kozmidok

Az oldal jelenlegi verzióját még nem ellenőrizték tapasztalt közreműködők, és jelentősen eltérhet a 2019. július 14-én felülvizsgált verziótól ; az ellenőrzések 5 szerkesztést igényelnek .

Kozmidok (Cosmides) - plazmidok , amelyek a lambda fág DNS- fragmensét tartalmazzák, beleértve a cos - szakaszt [1] . A fágrészecskék in vitro csomagolórendszereivel együtt vektormolekulaként használják génklónozáshoz és genomiális könyvtárak felépítéséhez. A kozmidokat először Collins és Brüning építette meg 1978-ban [2] . Nevük két kifejezés rövidítéséből származik: cos -section (maga a kifejezés az angol co hesive end s  - sticky ends szóból származik) és a plazmid .

A kozmidok 32-47 kb DNS-szegmensek klónozására használhatók . Plazmidok, ha 4-5 kb-nál nagyobb DNS-szakaszokat klónoznak beléjük. instabillá válnak a növekvő rekombinációs hajlam miatt . Ezenkívül a kozmidokat fágrészecskékbe csomagolják, ami lehetővé teszi, hogy transzdukcióval a baktériumokhoz kerüljenek .

Plot Cos

A cos régió körülbelül 200 bázispárból áll, és szükséges a kozmid fágrészecskévé való csomagolásához. Tartalmaz egy cosN helyet , amelyben az enzimtermináz 12 bp távolságra minden DNS- szálon egyetlen szálat tör el. egymástól. A ciklikus kozmid linearizálódik, és 12 bp ragadós végeket képez. (A DNS-nek lineárisnak kell lennie, hogy bejusson a fág fejébe). A cosB hely tartja a terminázt, miközben elvágja a DNS-t. A következő kozmid cosQ -helyét (mivel a gördülő gyűrűs replikáció gyakran konkatemerek kialakulásához vezet ) a termináz megtartja, miután az előző kozmidot becsomagolták. Ez lehetővé teszi a lineáris kozmidok védelmét a DNázok általi hasítástól.

A kozmidok szerkezete

Lényegében a kozmid a lambda fág DNS-e , amelyből minden gént eltávolítottak, kivéve a cos - helyet. A kozmid körülbelül 5 kb méretű.és szükségszerűen tartalmazza a következő elemeket: a lambda fág virionokba való becsomagolásához szükséges cos -helyet, egy bakteriális vagy eukarióta sejtben történő replikációs origót , restrikciós endonukleáz felismerési helyeket és egy markergént (például bármely antibiotikummal szembeni rezisztencia gént). ) [3] .

A kozmidok 32-47 kb DNS-szegmensek klónozására használhatók . Ehhez a kozmidot és az idegen DNS-t ugyanazzal a restrikciós endonukleázzal kezeljük, majd a kapott lineáris fragmenseket összekeverjük, és ligációs reakciót hajtunk végre. Ezután a DNS-t in vitro fágfejekbe csomagolják, és cos -helyeken vágják el . A szükséges vírusfehérjéket az E. coli cI857 ( vörös - gam - Sam és Dam (fej) és Eam (farok) lizátumából nyerik . Ezt a folyamatot a fragmentumok méret szerinti szelekciója kíséri , mivel csak a lambda fág genomjának 78-105%-os hosszúságú DNS csomagolható. Így a klónozott DNS-régiót tartalmazó, túlnyomórészt rekombináns kozmidok bejutnak a virionokba. A két kozmid közötti ligálás termékei túl kicsik lesznek a csomagoláshoz, az idegen DNS két fragmentuma között pedig nagyok lesznek.

A kapott fágrészecskéket rekombináns kozmidokkal E. coli sejtek fertőzésére használjuk. A citoplazmában a kozmidokat a ragadós végű kötődés és a ligáz enzim működése ciklizálja , majd szabályos plazmidokhoz hasonlóan replikálódnak anélkül, hogy a lambda-fág bármely tulajdonságát mutatnák. A transzformált sejtek szelekcióját a vektormolekulában jelenlévő markergén szerint végezzük.

Módosítások

Mivel a kozmidok lehetővé teszik a DNS viszonylag nagy szakaszainak klónozását, kényelmes vektorok az eukarióta genomfragmensek könyvtárainak létrehozására, amelyeket restrikciós endonukleázokkal történő részleges emésztéssel nyerünk . Az ilyen hasítás termékei azonban különböző méretűek lehetnek, és vannak olyan esetek, amikor két, a genomban nem szomszédos, viszonylag kis fragmentumot ligálnak, és létrejön a megfelelő klón, amely hamis benyomást kelt a kromoszómákban elfoglalt helyzetükről. . Ez a probléma megoldható a részleges emésztési termékek méret szerinti frakcionálásával. Azonban még ez a módszer sem kerüli el teljesen a több ligált DNS-fragmenst tartalmazó kozmid klónok megjelenését, ezért más módszereket is javasoltak, különösen az idegen DNS-fragmensek defoszforilációját, hogy azok ne kapcsolódhassanak egymással. Speciális pJB8 (Burke és Ish-Horowicz, 1981) és c2XB (Bates és Swift, 1983) kozmid vektorokat is létrehoztak, amelyek használatával minimálisra csökkentik a hamis klónok kialakulásának valószínűségét.

A pWE és sCos sorozat modern kozmidjaira jellemző, hogy több klónozóhely található, amelyeket fágpromoterek vesznek körül, valamint egyedi felismerési helyeket a Not I, Sac II és Sfi I restrikciós endonukleázok, amelyek lehetővé teszik, hogy egy enzim kivágja az inszertet.

Jegyzetek

  1. Hohn Barbara, Murray Kenneth. Rekombináns DNS-molekulák csomagolása bakteriofág részecskékbe in vitro   // Proc . Nati. Acad. sci. USA: folyóirat. - 1977. - augusztus ( 74. köt. , 8. sz.). - P. 3259-3263 . - doi : 10.1073/pnas.74.8.3259 .
  2. Collins John, Hohn Barbara. Kozmidok: a plazmid génklónozó vektor típusa, amely in vitro becsomagolható bakteriofág lambda fejekbe   // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America  : Journal. - 1978. - szeptember 1. ( 75. évf. , 9. sz.). - P. 4242-4246 . - doi : 10.1073/pnas.75.9.4242 .
  3. Kozmidok . Phillip McClean. Letöltve: 2014. április 4. Az eredetiből archiválva : 2014. március 26..

Források