Dot blotting

A Dot blot  egy olyan technika, amelyet a molekuláris biológiában használnak különböző makromolekulák, például nukleinsavak vagy fehérjék kimutatására. Ez a technika a Western blot némi leegyszerűsítése : a vizsgált makromolekulákat tartalmazó mintákat azonnal nitrocellulóz- vagy PVDF-membránra visszük fel, megkerülve a PAAG-ban végzett előzetes elektroforézis szakaszát (különösen, ha fehérjékkel dolgozunk).

Protokoll a PVDF membránnal való munkavégzéshez

  1. Vigye fel a vizsgálati mintákat a száraz PVDF membránra (pontonként 1-3 µl oldat). Ha PVDF membránnal dolgozik, a puffernek, amelyben a mintákat feloldjuk, kellően nagy ionerősségűnek kell lennie , különben az oldat egyszerűen nem kerülhet be a membránba hidrofób tulajdonságai miatt.
  2. A membránt meg kell szárítani. Általában 30 perc szobahőmérsékleten elegendő.
  3. Helyezze a membránt pufferbe, hogy csökkentse a nem specifikus antitestek kötődését. A nem specifikus kölcsönhatásokat csökkentő szer szerepét általában a szarvasmarha-szérumalbumin (BSA) vagy a tejpor tölti be . 20 perc - 1 óra szobahőmérsékleten.
  4. Helyezze a membránt primer antitest pufferbe. BSA vagy tejpor is jelen van ebben a pufferben, de kisebb mennyiségben. 1 óra - BE, T = 4 С°.
  5. Mossa le a membránt 3x5 percig.
  6. Helyezze a membránt olyan pufferbe, amely másodlagos antitestet tartalmaz, amely kimutatási szert, például torma-peroxidázt tartalmaz . 1-2 óra szobahőmérsékleten.
  7. Mossa újra a membránt 3x5 percig.
  8. Helyezze a membránt a detektáló oldatba. Jobb, ha 30%-os hidrogén-peroxidot adunk a kereskedelmi forgalomban kapható oldathoz (kb. 10-50 µl/10 ml oldat). 1-3 percig szobahőmérsékleten.
  9. Érzékelés. Torma-peroxidázzal végzett másodlagos antitestek alkalmazása esetén kemilumineszcens sugárzás figyelhető meg, amelyet a szubsztrát torma-peroxidázzal történő kivágása okoz a detektáló oldatból. Kemilumineszcenciát regisztráló eszköz használata esetén elég kis expozíció (legfeljebb 2 perc)

Lásd még