A kromatin kölcsönhatás elemzése páros végű tag szekvencia segítségével (ChIA-PET) egy molekuláris biológiai módszer, amely lehetővé teszi a genomban egymástól jelentős távolságra elhelyezkedő kromatin régiók kölcsönhatásainak (térbeli közelségének) meghatározását . [1] Az ilyen kölcsönhatások fontosak a szabályozási elemek meghatározása szempontjából . A sejtekben a szabályozó elemek jelentős távolságra helyezkedhetnek el a szabályozott gén promoterétől (például cisz-szabályozó elemek , transz-szabályozó elemek , szigetelők , enhanszerek ). Az ilyen kölcsönhatások mechanizmusának megértéséhez ismernünk kell a kromatin régiók egymáshoz viszonyított térbeli elrendeződését, amit ez a módszer lehetővé tesz de novo . A kapott információk viszont fontosak a génexpresszió szabályozási mechanizmusainak megértéséhez . [2]
A ChIA-PET a ChIP , a 3C ( Chromosome Conformation Determination ) és a Paired - end tag szekvenáláson alapul , amelyekhez nagy áteresztőképességű szekvenálást és az eredmények további számítógépes feldolgozását alkalmazzák. [3]
A módszert először 2009-ben [1] használták távoli ER-alfa kötőhelyek meghatározására emberi emlőrákban. Ezt követően például CTCF által közvetített interaktóm (a lehetséges kölcsönhatások térképe) megalkotására használták egérembrionális őssejtekben [4] .
A ChIA-PET egyesíti a ChIP és a 3C [5] alapú módszerek képességeit, javítva mindegyik képességét. A hagyományos ChIP módszer lehetővé teszi egy adott fehérje és a DNS közötti kölcsönhatás meghatározását, és használható transzkripciós faktor kötőhelyek keresésére . A ChIP-seq segítségével a kívánt fehérje de novo kötőhelyei meghatározhatók a teljes genomban. Ha egy fehérje megköti a kromatin olyan régióit, amelyek a kromoszómán egymástól távol, de térben közel vannak, a ChIP-seq mindegyiket azonosítani tudja, de nem jelzi kölcsönhatásukat. Azonban nem minden ChIP-seq módszerrel meghatározott szekvencia van egyedileg térképezve a genomban, és nem mindegyik funkcionális kötőhely [6] .
A 3C és a ChIA-PET módszerek a proximális ligálás ( proximity ligation ) elméletén alapulnak , amely szerint a fehérjekomplexhez kapcsolódó kromatin régiók közeli végei nagyobb valószínűséggel ligálódnak egymáshoz, mint a régiók végei oldatban vagy más fehérjekomplexhez kapcsolódnak.
A 3C módszer lehetővé teszi a kromatin térszerkezetének meghatározását, de nem teszi lehetővé a kölcsönhatásba lépő fehérje meghatározását [5] . Jelentős probléma a kölcsönható lókuszok sorrendjének pontos ismerete . Ez szükséges a primerek kiválasztásához a meghatározásukra használt kvantitatív vagy félkvantitatív PCR analízishez . (Meg kell jegyeznünk, hogy a 3C módszerrel meghatározott több lókusz – kölcsönhatásra jelölt – lehet). A ChIA-PET módszer lehetővé teszi egy adott fehérjéhez kapcsolódó kromatin térszerkezetének de novo meghatározását. Ez egyrészt nem igényli a DNS-szekvencia ismeretét a kölcsönhatás területén, másrészt teljesen függ a felhasznált antitestek specifitásától .
| Forgács | ChIP szekv | ChIA-PET | 3C | |
|---|---|---|---|---|
| Specifikus antitestekre van szükség | + | + | + | - |
| Ismerni kell a vizsgált lókusz DNS-szekvenciáját | + | - | - | + |
| Referenciagenom szükséges | - | + | + | - |
| A módszer információt nyújt arról | Kötési oldalak | A de novo kötőhelyekről |
A de novo kötőhelyekről + kromatin konformációról |
Kromatin konformációk |
A DNS-fehérje komplexek nem specifikusan térhálósodnak formaldehiddel. A mintát ultrahangnak tesszük ki , miközben a DNS-molekulákat töredékekre zúzzuk, és a lazán kötött, nem specifikus komplexeket megsemmisítjük. Ennek eredményeként a DNS-fragmenseket fehérjékkel erős komplexekben nyerik. Továbbá a mágneses gyöngyökön rögzített specifikus antitestek segítségével a kérdéses fehérjéhez kapcsolódó kromatinfragmensek kicsapódnak. A vizsgálat tárgya gyakran ismert transzkripciós faktorok [1] . A kicsapódott komplexeket mágneses gyöngyök segítségével távolítják el az oldatból. Az izolált komplexeket 2 aliquot részre osztják, és ismert szekvenciájú oligonukleotid- féllinkereket "varrnak" a DNS-molekulák végére . Az A féllinker az egyik alikvot részben, a féllinker B pedig a másikban található. Mindkét féllinker tartalmazza az MmeI restrikciós enzim által felismert helyet, és két nukleotid „vonalkódja” különbözik egymástól : CG a félig A linker A, a B féllinker esetében pedig AT. Ennek eredményeként később, a szekvenálás során a linkereket a „vonalkód” alapján meg lehet különböztetni egymástól. A következő lépésben két alikvot részt egyesítünk, és proximális ligálás következik be, melynek során a fél-linkereket egymás tetejére ligálják, hogy teljes hosszúságú linkereket képezzenek. Az AA (CG/CG) vagy BB (AT/AT) „vonalkódokkal” rendelkező linkerek ugyanazon a komplexen belül valószínű ligációs terméknek számítanak, míg az AB (CG/AT) „vonalkódokkal” rendelkező linkerek a különböző DNS-hez kapcsolódó kiméra ligációs termékeknek minősülnek. fehérjekomplexek A szekvenálás előkészítése magában foglalja a komplexek MmeI restrikciós enzimmel történő feldolgozását [8] , amely a DNS-t a felismerési helyétől bizonyos távolságra a féllinkerben hasítja. Ennek eredményeként ennek a szakasznak a végén olyan konstrukciókat kapunk, amelyek a teljes linker (38 bp) mindkét oldalán egy pár "címkét" ( eng. tag ) tartalmaznak (mindegyik 20 bp). A kapott fragmenseket mindkét végén szekvenálják ( PET ) . A címkéket ezután leképezzük a genomra. [7] [9]
A szekvenálási eredmények számítógépes feldolgozása 6 modulból áll [7] [10]
Minden olvasási szekvencia olvasható "vonalkódokkal" és olvashatatlan "vonalkódokkal" rendelkező szekvenciákra van felosztva. Ha a „vonalkód” nem olvasható, akkor a szekvencia „eldobásra kerül” a feldolgozásból. Ha a „vonalkód” olvasható, akkor a szekvenciák a linkerekhez igazodnak. Valamennyi kapott szekvenciát kiméra (különböző komplexekből származó DNS ligálásával keletkezik, és A/B linkert tartalmazó) és nem kiméra (A/A vagy B/B linkert tartalmazó) szekvenciákra osztjuk. Megjegyzendő, hogy az A/A-t vagy B/B-t tartalmazó szekvenciák között kimérák is előfordulhatnak. Továbbá maguk a linkerek szekvenciáit "eldobják", és a "címkék" (PET-ek) szekvenciáit elemzik. [7] [10]
PET-ek feltérképezéseAz előző lépésben kapott szekvenciákat a referencia genomhoz térképezzük fel. Az első szakaszban 100%-ban egymáshoz illesztett szekvenciákat izolálnak , amelyek egy lókuszhoz (egyedi) vagy több lókuszhoz térképezhetők fel. A fennmaradó szekvenciák közül azokat izoláljuk, amelyek a szekvenciában 1 szubsztitúciót ( angol missmatch ) tartalmaznak a referencia genommal, ezeket szintén egyedi és többszörös leképezésű szekvenciákra osztjuk. Az összes többi szekvencia nincs leképezve. Az egyedileg leképezettek kivételével minden szekvencia „eldobásra kerül” a feldolgozásból. [7] [10]
PET-ek osztályozásaA PET-eknek két csoportja van: "self-ligated" ( angol self-ligation PET ) és "interligated" ( angol inter-ligation PET ). Az "önligált" ( angolul self-ligation PET ) egy ChIP-DNS fragmentum végeinek felel meg, ezeknek ugyanazon a kromoszómán kell elhelyezkedniük egymástól kis távolságra, "fejtől farokig" orientációban. Az "interligált" ( eng. inter-ligation PET ) intrakromoszómálisra (nagy távolságra ugyanazon a kromoszómára térképezve), interkromoszómálisra (különböző kromoszómákra térképezve) és különböző orientációs címkékre ligálva ( különböző orientációjú ligációs PET -ekre) ( térképezett ) oszthatók . ugyanazon a kromoszómán, kis távolságra, de rossz orientációban vagy különböző DNS-szálakon). Az „önligált” PET-eket az „interligált” PET-ektől elválasztó határt természetesen az adott „hang” intenzitás mellett kapott DNS-fragmensek hossza határozza meg. Különböző kísérletekben 3-4,6 Kb volt. [7] [10]
Fehérjekötő helyek meghatározásaAz önligációs címkéket ( önligáló PET- eket ) a fehérjekötő helyek meghatározására használják . Az eljárás hasonló a ChIP-seq- ben használthoz .
A kromatin kölcsönhatások meghatározásaAz ilyen típusú interakciók előrejelzéséhez " interligációs" PET-eket használnak .
Az eredmények megjelenítése és rendszerezéseAz előző szakaszok adatai adatbázisokba kerülnek tárolásra, feldolgozásra és esetleges megjelenítésre.
A ChIA-PET kísérletekben a következő számítógépes programokat használjuk