CRISPR Cas13

A CRISPR-Cas13 egy RNS-nukleáz , amely az RNS- lebontás céljára használható [1] . A Cas13 enzimeknek két HEPN endoRNáz doménje van (magasabb eukarióták és prokarióták nukleotid-kötődése) [2] . A célzáshoz ez az enzim irányító RNS-t (gRNS) használ . A CRISPR RNS (crRNS) szekvencia és egy komplementer egyszálú RNS (ssRNS) target párosításával történő aktiváláskor a Cas13 effektor a cél RNS hasítását okozza, ugyanakkor a Cas13 ribonukleáz aktiválásához szinte tökéletes komplementaritás szükséges a célpont között RNS és a Cas13-asszociált vezető RNS [3] . Mivel a programozott Cas13 irányító RNS szekvencia körülbelül háromszor nagyobb, mint az eredeti shRNS szekvencia , a CRISPR-Cas13 által közvetített transzkripciós elnémítás nagyobb célszelektivitást biztosít a kutatóknak. További előnye, hogy a Cas13-nak nincs szüksége PAM (Protospacer szomszédos motívum) szekvenciára , ami elméletileg lehetővé teszi, hogy az RNS szinte bármely régióját megcélozza [4] .

Azonban ellentétben az Argonaute fehérjékkel , amelyek csak a cisz-helyzetben lévő komplementer RNS-eket vágják, a Cas13 a cisz -helyzetben lévő komplementer RNS-ek mellett a közeli, nem komplementer RNS-eket is elpusztíthatja a transz pozícióban , ami korlátozza a Cas13 egyes altípusainak használatát. in vivo [5] . Ez annak köszönhető, hogy a Cas13 nukleáz domének a fehérje exponált felületén helyezkednek el, távol a crRNS-t kötő zsebtől a cél-RNS-hez [3] [6] .

Azonban nem minden CRISPR Cas13 rendszer egyforma, némelyikük lehetővé teszi a mellékhatások minimalizálását. Így a Cas13d-N2V8 mutációt tartalmazó high-fidelity variáns, a hfCas13d (high-fidelity Cas13d), a vad típusú Cas13-hoz hasonló RNS-leütési aktivitást mutat, de nem mutat jelentős mellékkárosodást transzgenikus egerekben [7] . Az RNS-célzott hfCas13d enzimet használó új génszerkesztési megközelítés biztonságosabb, mivel az RNS-ek átmeneti molekulák, amelyek csak rövid ideig léteznek a sejtben, és nem integrálódnak a genomba [8] . Ezért a CRISPR-Cas13-at használó precíz RNS-szerkesztő rendszerek potenciálisan terápiás célokra használhatók, ha átmeneti változásra van szükség a sejtműködésben. Például olyan kompakt Cas13bt-REPAIR enzimeket fejlesztettek ki, amelyek az AAV adenovírus vektorba helyezhetők, és segítségével funkcionálisan fontos célpontok, például fehérje foszforilációs helyek szerkeszthetők [9] . Konkrétan egy kodon szerkesztésével olyan helyen, amely elősegíti a béta-katenin lebomlását a foszforiláció során , 52-szeresére sikerült növelni a Wnt/béta-catenin útvonal jelátvitelét , amely szükséges a máj regenerációjának stimulálásához . [9] .

A katalitikusan dezaktivált Cas13d enzim és az IF-3 transzlációs iniciációs faktor fuzionálásával lehetővé vált a dCasRx-IF3 fehérje transzláció programozható aktivátorának előállítása , és segítségével szelektíven fokozva bizonyos fehérjék szintézisét poszttranszkripciós szinten . 10] .

Jegyzetek

  1. ↑ Ashraf, S., Ghouri, MZ, Javed, M.A., Zafar, H., Ali, H., Qari, SH és Ahmad, A. (2022). RNS szerkesztés CRISPR/Cas13 segítségével. In The CRISPR/Cas Tool Kit for Genome Editing (219-254. oldal). Springer, Szingapúr. doi : 10.1007/978-981-16-6305-5_7
  2. ↑ Cox, DB, Gootenberg, JS, Abudayyeh, OO, Franklin, B., Kellner, MJ, Joung, J. és Zhang, F. (2017). RNS-szerkesztés CRISPR-Cas13-mal. Science, 358(6366), 1019-1027. PMID 29070703 PMC 5793859 doi : 10.1126/science.aaq0180
  3. ↑ 1 2 Ai, Y., Liang, D. és Wilusz, JE (2022). A CRISPR/Cas13 effektorok eltérő mértékű off-target hatást mutatnak, ami korlátozza hasznosságukat eukarióta sejtekben. Nukleinsavak kutatása, 50(11), e65-e65. PMID 35244715 PMC 9226543 doi : 10.1093/nar/gkac159
  4. ↑ Goel, K. és Ploski, JE (2022). RISC-y Business: A rövid hajtű RNS-közvetített géncsendesítés korlátai az agyban és a CRISPR/Cas-alapú alternatívák megbeszélése. Frontiers in Molecular Neuroscience, 15, 914430 PMID 35959108 PMC 9362770 doi : 10.3389/fnmol.2022.914430
  5. ↑ Li, Y., Xu, J., Guo, X., Li, Z., Cao, L., Liu, S., ... & You, F. (2022). A 28s rRNS RfxCas13d általi kollaterális hasítása egerek halálát okozza. bioRxiv. doi : 10.1101/2022.01.17.476700
  6. ↑ Li, Z., Li, Z., Cheng, X., Wang, X., Ma, S., Wang, S., ... & Fei, T. (2022). A belső RNS-célzás korlátozza a CRISPR-Cas13 rendszerek használhatóságát. bioRxiv. doi : 10.1101/2022.05.14.491940
  7. ↑ Tong, H., Huang, J., Xiao, Q., He, B., Dong, X., Liu, Y., ... & Yang, H. (2022). Nagy pontosságú Cas13 variánsok a célzott RNS lebontáshoz minimális mellékhatásokkal. Természet Biotechnológia, 1-12. doi : 10.1038/s41587-022-01419-7 ; (2021). bioRxiv pdf doi : 10.1101/2021.12.18.473271
  8. ↑ A kutatók állítólag egy új „szabályozható, visszafordítható” génszerkesztési módszert hoznak létre Kínában. Archiválva : 2022. augusztus 20. a Wayback Machine -nél . A minimális mellékhatással rendelkező Cas13 variánsok várhatóan versenyképesebbek lesznek az in vivo RNS-szerkesztésben és a jövőbeni terápiás alkalmazásokban, állítják a kutatók.
  9. ↑ 1 2 Kannan, S., Altae-Tran, H., Jin, X., Madigan, VJ, Oshiro, R., Makarova, KS, ... & Zhang, F. (2022). Kompakt RNS szerkesztők kis Cas13 fehérjékkel. Nature biotechnology, 40(2), 194-197. PMID 34462587 PMC 8929162 doi : 10.1038/s41587-021-01030-2
  10. ↑ Otoupal, PB, Cress, BF, Doudna, JA és Schoeniger, JS (2022). CRISPR-RNAa: a transzláció célzott aktiválása dCas13 fúziókkal a transzlációs iniciációs faktorokhoz. Nucleic Acids Research, 50(15), 8986-8998. PMID 35950485 PMC 9410913 doi : 10.1093/nar/gkac680

Irodalom

 Biomérnökség
A biomérnökség területei
Kapcsolódó cikkek
Tudósok
Népszerűsítők