A kéthibrid elemzés olyan molekuláris biológiai módszer, amely lehetővé teszi a fehérje-fehérje és a DNS-fehérje kölcsönhatások nagy pontosságú kimutatását in vivo körülmények között .
Fizikailag és funkcionálisan elválasztható doménekből álló transzkripciós faktorok használatán alapul : DNS-kötő ( kötődomén, BD ) és aktivátor domén ( aktivációs domén, AD ). Két rekombináns fehérje fizikai kölcsönhatása elindítja a velük "keresztkötésű" transzkripciós domének fúzióját, aktiválva a riportergének expresszióját .
A kéthibrid analízis módszerét először S. Fields és O. Song írta le és alkalmazta 1989-ben [1] , amikor Saccharomyces cerevisiae élesztőgombában vizsgálták a GAL4 transzkripciós faktort . Azóta azonban a fehérje-fehérje kölcsönhatások GAL4 transzkripciós aktivátor segítségével történő kimutatásának elvét adaptálták más alternatív módszerek létrehozására, beleértve néhányat, amelyek képesek DNS-fehérje és DNS-DNS kölcsönhatások, valamint több fehérje komplexek kimutatására.
Emellett az élesztőn kívül Escherichia colit [2] és emlőssejteket is használnak .
A kéthibrid analízis módszere a galaktozidáz proteint kódoló GAL gén promótereinek szerkezeti sajátosságain alapul . Ezeknek a géneknek a promoterei a TATA boxból , az UAS aktivátor szekvenciából és az Inr iniciációs motívumból állnak. A galaktóz megjelenése a sejtben konformációs változásokhoz vezet a szabályozó fehérjékben , ami lehetővé teszi, hogy a Gal4p fehérje aktivátorként kezdjen működni különböző GAL-promotereken [3] .
A GAL4p transzkripciós aktivátor egy 881 a.a hosszúságú, endogén expressziós fehérje, amely 2 domént tartalmaz : DNS-kötőt (1-147 a.a.) és aktivátort (771-881 a.a.). A természetes transzkripciós faktorokban ezek a domének egyetlen fehérjegömb részei, de külön is szintetizálhatók, megőrizve eredeti funkciójukat.
Példaként ismertetjük a fehérjék közötti kölcsönhatások kimutatására használt klasszikus kéthibrid rendszerű módszer eszközét. A protein A és B fehérje közötti kölcsönhatás vizsgálatára rekombináns molekulákat hoznak létre , amelyek közül az egyik a protein A a DNS-kötő doménhez (A-CD), a másik pedig a B fehérje az aktivátor doménnel fuzionálva. ROSSZ). A kiméra fehérjék összetételében a domének megtartják funkciójukat. Külön-külön mindegyik rekombináns molekula nem képes a transzkripció aktiválására , azonban a közvetlen közelségben, valószínűleg az A és B fehérjék közötti kölcsönhatás miatt, a GAL4p fehérje eredeti funkciója újrateremtődik, és a riportergén aktiválódik [4 ] [5] .
Az élesztő két-hibrin szűrése gyakran genetikailag módosított élesztőtörzseket használ , amelyekből hiányzik bizonyos tápanyagok (jellemzően aminosavak vagy nukleinsavak ) bioszintézise . Az ilyen törzseket auxotrófoknak nevezzük . Ha ezeket a tápanyagokat nem tartalmazó táptalajokon termesztjük , az élesztő elpusztul. Ezután két auxotróf törzset transzfektálunk olyan plazmidokkal , amelyekben a galaktozidáz promoter szabályozza a hiányzó metabolikus útvonalelemet kódoló gén transzkripcióját . Az egyik plazmid a protein A génjét is tartalmazza majd SD-vel fuzionálva. Ebben az esetben a protein A általában ismert. A második plazmid az AD fúziós B fehérje gént tartalmazza. Ebben az esetben a B fehérje lehet egy ismeretlen funkciójú fehérje, ellenőrizni kell az A proteinhez való kötődés lehetőségét, vagy egy B-AD fúziós fehérje gént tartalmazó plazmid helyett egy egész könyvtár lehet különböző . különböző fehérjék génjeit tartalmazó plazmidok AD-vel fuzionálva. Így a fehérjekönyvtárat átvizsgálják a protein A-val való kölcsönhatás lehetőségére. A könyvtárat használó módszerek feltételezik, hogy csak egy pár plazmid kerül be a vizsgált sejtbe, így minden sejt legfeljebb egy fehérjét termel a könyvtárból. Ezután két auxotróf törzset keresztezünk [2] . Az így létrejövő hibridben az A és B közötti sikeres interakció esetén az AD és SD domének közvetett módon összekapcsolódnak, és az AD a riportergén transzkripciós kezdőhelyének közvetlen közelében van. A kapott törzs nem lesz auksotróf. Interakció hiányában nincs transzkripció, a hibrid auxotróf. Ezért a sikeres interakció a sejt fenotípusának megváltozásával jár .
A kéthibrid elemzés nem igényel speciális drága berendezéseket, és lehetővé teszi teljes könyvtárak elemzését. Ennek a módszernek azonban jelentős hátránya a nagyszámú hamis pozitív eredmény .
Ez a módszer ugyanazokon az elveken alapul, mint a kéthibrid rendszer, azzal a különbséggel, hogy az A és B fehérjék nem lépnek közvetlenül kölcsönhatásba egymással. Közöttük van egy harmadik elem, az X anyag. Ez az anyag lehet egy DNS- vagy RNS -molekula , egy kisméretű szerves ligandum , egy inhibitor , amely kovalensen kötődik az enzim aktív centrumához . A módszer lehetővé teszi az NK -fehérje kölcsönhatások, az adott szubsztráthoz viszonyított enzimaktivitás , a fehérje kis molekulákkal való kölcsönhatásának azonosítását [4] .
A fő különbség a "közvetlen" kéthibrid rendszertől itt az, hogy az a gén, amelynek expresszióját ez a rendszer szabályozza, halálos. Így, ha kölcsönhatás lép fel az A és B fehérjék között, a hibrid szervezet elpusztul. Ezt a módszert az A és B globulák közötti kölcsönhatáshoz szükséges aminosavak meghatározására használják [4] .
A klasszikus módszer ezen módosításában egyetlen rekombináns molekula van, az AD-A-B-SD. Ebben az esetben egy ismert DNS- szekvencia kerül beépítésre a riportergén elé , a BD változó. Ily módon meg lehet határozni, hogy egy adott DNS-szekvenciához mely fehérjék kötődnek [4] .
Feltételezhető, hogy bármely élő sejt felhasználható kéthibrid rendszer megvalósítására, azonban gyakorlati megfontolások vannak a kiválasztott sejtvonal alacsony költségével és stabilitásával kapcsolatban [6] .
Történelmileg a kéthibrid rendszer első organizmusa az élesztő . Az élesztő stabil, egyszerű és jól tanulmányozott modellszervezet . Az élesztősejtek semleges pH -értéket tartanak fenn a sejten belül a külső környezet savas pH -értékei ellenére. Az élesztőgombák az extracelluláris toxinokra is gyengén érzékenyek, molekuláris módszerek nélkül is manipulálhatók [7] Fontos megjegyezni, hogy szükség van a nukleáris lokalizációs jelekre , mivel az élesztő teljes genetikai apparátusa a sejtmagban lokalizálódik. Ezek hiányában egy potenciálisan kölcsönhatásba lépő fehérjepár nem transzlálódik, és nem lép kölcsönhatásba.
A bakteriális rendszerek az élesztőrendszerekhez hasonlóan használhatók. Nyilvánvalóan több lehetőségük van, és előnyösebb a kéthibrid rendszer használatához. A bakteriális rendszerek lehetővé teszik a 10 8 -nál nagyobb könyvtárak használatát és elemzését, gyorsabb növekedési sebességgel és nagyobb potenciállal rendelkeznek a kis molekulák permeabilitására. Nincs szükség nukleáris lokalizációs jelekre , és lehetővé válik az élesztőre mérgező fehérjék tanulmányozása. A gyorsabb szelektív módszereknek köszönhetően alacsony hamis pozitív arány (3·10 −8 ) [6] biztosított .
A fehérjék kölcsönhatásának vizsgálatakor lehetőség nyílik új funkciók azonosítására. Egy ismert A 0 fehérje , ismeretlen B n fehérjék könyvtára felhasználásával , majd ezt követően egy korábban ismert A 0 B 0 kölcsönhatásba lépő fehérjepárral történő összehasonlítással információt kaphatunk a B n és a B 0 hasonlóságáról . Hasonló adatok nyerhetők egy ismert fehérjekönyvtár és egyetlen, ismeretlen funkciójú fehérje kölcsönhatásainak tanulmányozásával [7] .
A kéthibrid rendszert akkor használják, ha egy pár ismert és kölcsönhatásban lévő fehérje esetében meg kell határozni azokat az aminosavmaradékokat , amelyek kölcsönhatásuk területét képezik. Ennek érdekében a specifikus aminosavaknak megfelelő DNS-bázispárokban mutációkat hajtanak végre az alkalmazott plazmidokban . Így létrejön egy olyan könyvtár az aminosav-maradékok pontváltozásaival, amely alapján egy kéthibrid rendszer segítségével meghatározható egy adott aminosav jelentősége a partnerfehérjével való kölcsönhatás kialakításában [7 ] .
A modern módszerek lehetővé teszik, hogy egy tanulmányozásra kiválasztott sejtet úgy hozzunk létre, hogy az tükrözze a tanulmányozásra kiválasztott egyik vagy másik molekuláris aspektust. Az ilyen sejtekben lehetővé válik a két-hibrid rendszer által közvetített gyógyszeradagolás specifitásának és pontosságának tesztelése, ami lehetővé teszi a felmerülő mellékhatások problémáinak gyors megoldását.
Hasonló megközelítést alkalmaznak a toxinok és mérgek esetében [7] .
A cinkujj fehérjék ( cink ujj fehérjék vagy ZFP-k) keresésére sikeresen alkalmaztak kéthibrid elemzésen alapuló módszereket [2] . DNS-kötő fehérjeként a ZFP -t nem szabványos DNS-kötő domének létrehozására használják, amelyek a DNS-szekvencia egy előre meghatározott régiójához koordinálódnak.
A módszer egy ZFP könyvtár létrehozásán alapul bizonyos aminosavak véletlenszerű megváltoztatásával. Továbbá ezek közül kiválasztják azokat, amelyek képesek kölcsönhatásba lépni az UAS-ban szereplő célhellyel, a kívánt jellemzőknek megfelelően. Azonban mindegyik ZFP csak egy kis DNS-szakaszt, körülbelül 3-4 bázist ismer fel, ezért két konstans szekvenciájú ZFP -ből álló komplexet használnak a kötési pontosság javítására és az UAS-n kívüli helyek felismerésének megakadályozására . Az ilyen komplexekből származó ZFP -k a célterület szélein kötődnek, és megakadályozzák a kötődést az UAS-on kívül [2] .
Számos más DNS-kötő domén is vizsgálható ezzel a rendszerrel.