A mesterséges genom a biológiai kutatás egyik iránya, amely a meglévő szervezetek genetikai módosításával kapcsolatos, új tulajdonságokkal rendelkező szervezetek létrehozása érdekében. A géntechnológiával ellentétben a mesterséges genom kémiailag szintetizált génekből áll.
Feltételezhető, hogy a jövőben mesterséges genomokat lehet létrehozni nem DNS alapján, vagy más nukleotidkészlet és más kódolási elvek felhasználásával, mint a természetes genomokban. Így a mesterséges genomok létrehozása a szintetikus biológia egyik területe .
Meg kell érteni, hogy miközben a természetes genetikai kódokkal vagy azok csekély módosításával rendelkező gének szintéziséről beszélünk . Bármilyen előre meghatározott polipeptidet kódoló mesterséges gént szintetizálni lehet , de még mindig lehetetlen egy alapvetően új polipeptidet úgy megtervezni, hogy az legalább fehérjegömbölyű legyen, nem beszélve arról, hogy az így létrejövő fehérje enzimként kezd működni .
Jelenleg a legmagasabb eredmény a mesterséges genom létrehozása terén a Mycoplasma mycoides baktérium kromoszómájának szintézise, amelyet Craig Venter hajtott végre 2010-ben.
2010-ben a Craig Venter Institute munkatársaisikerült mesterségesen szintetizálnia a Mycoplasma mycoides baktérium 1 077 947 nukleotidpár méretű ciklikus kromoszómáját [1] . A kromoszómát a Mycoplasma capricolum baktérium sejtjébe ültették be , melynek osztódása után sejt keletkezett, amelyet teljesen mesterséges genom vezérelt.
Ez a mesterséges genom ma JCVI-syn1.0 kódnéven ismert. Szinte teljesen megismétli a Mycoplasma mycoides baktérium egyik törzsének genomját , kivéve több mesterségesen bevitt genetikai markert ( angol watermark, watermarks ), több, a szintézis során eltávolított jelentéktelen gént és 19 mutációt, amelyek az összeállítás során keletkeztek. DNS- fragmensek . A mesterséges genommal rendelkező sejtek normálisan működnek, és többszörös osztódásra is képesek.
A mesterséges genommal kapcsolatos munka Frederick Sanger és munkatársai munkájával kezdődött, akiknek 1977 -ben sikerült megállapítaniuk a φX174 bakteriofág genom teljes nukleotidszekvenciáját, 5375 nukleotidpár hosszúságban [2] . Tizennyolc évvel később, 1995-ben Craig Venter csoportja először szekvenálta meg egy önszaporodó szervezet, az 1 830 137 párból álló Haemophilus influenzae baktérium genomját [3] .
Az elmúlt 25 évben (1985-2010) a genomszekvenálás sebessége legalább 8 nagyságrenddel nőtt. Azon élőlények számának robbanásszerű növekedése, amelyeknek genomját leolvasták, felvetette az egyes gének szervezetben betöltött biológiai szerepének megértésének problémáját. Egészen a közelmúltig nem volt világos, hogy a genom tartalmaz-e teljes információt a szervezet felépítéséről, és életképes lesz-e egy kémiailag szintetizált genommal rendelkező szervezet. A molekuláris biológia előtt álló másik kérdés az volt, hogy a baktériumok genomja a minimálisan szükséges, és mi az a minimális génkészlet, amely élő sejtet hozhat létre.
1996- ban Arkady Mushegyan és Evgeny Kunin ( Nemzeti Biotechnológiai Információs Központ , USA ) azt javasolta, hogy a Gram -negatív Haemophilus influenzae baktérium és a Gram-pozitív Mycoplasma genitalium baktérium által megosztott 256 ortológ gén jó közelítés a minimális mennyiséghez. sejtgének [4] . 2004- ben a Valenciai Egyetem ( Spanyolország ) kutatóinak egy csoportja egy 206 fehérjét kódoló génből álló készletet javasolt, amelyet számos bakteriális genom elemzéséből nyertek [5] .
Craig Venter csoportjának tudósai 1995 óta hoznak létre egy minimális mesterségesen szintetizált genommal rendelkező organizmust [1] . 1995-ben szekvenálták a Mycoplasma genitalium genomját, amely az emberi húgyúti rendszer betegségeinek kórokozója, a legkisebb eddig ismert szervezet, amely képes szaporodni. Ez a mikroorganizmus 517 gént tartalmaz, amelyek közül 482 fehérjét kódol . A genom teljes térfogata 580 ezer nukleotidpár. 1999 - re a transzpozonok elhelyezkedését szekvenált genomokban elemezve sikerült megállapítani, hogy egy szervezet számára 265-350 gén létfontosságú, és több mint 100 génnek ismeretlen a rendeltetése [6] . A további kutatások 2005 -ig a létfontosságú gének listáját 382-re bővítették [7] .
Később még kisebb prokarióta genomokat fedeztek fel, de ezek mind kötelező szimbiontákhoz – autonóm létezésre képtelen szervezetekhez – tartoznak.
2003-ban szekvenálták a 490 885 párból álló Nanoarchaeum equitans genomot [8] . Azt is megállapították, hogy a Buchnera faj szekvenálatlan genomja körülbelül 450 ezer pár hosszúságú [9] .
Az eddig dekódolt baktériumgenomok közül a legkisebb a Carsonella baktérium intracelluláris endoszimbiontájának genomja, amely 159 662 nukleotidpárból áll, és mindössze 182 fehérjét kódoló gént tartalmaz. Ezt a genomot japán kutatók szekvenálták 2006-ban [10] .
Craig Venter csoportja kifejlesztett egy technológiát nagy DNS -molekulák szintézisére, amely 5-7 ezer pár méretű, kémiailag szintetizált fragmentumokon, úgynevezett kazettákon alapul . A fragmenseket részben in vitro megfelelő enzimekkel , részben Saccharomyces cerevisiae élesztősejtben in vivo rekombinációval állítottuk össze . A teljes szintetikus genomot sikeresen klónozták centromer plazmidként (YCp) élesztősejtekbe [11] .
A mesterséges genom létrehozására tett első kísérlet 2008-ban egy 582 970 pár hosszú Mycoplasma genitalium kromoszóma szintéziséből állt. A kémiailag szintetizált polinukleotidokból összeállított, 5-7 ezer pár méretű, egymást átfedő kazettákat enzimek segítségével egymás után 24, 72 és 144 ezer pár méretű (1/24, 1/8 és 1/) fragmentummá egyesítettük. 4, illetve a genom). A genom négy komponensből történő teljes összeállítását rekombinációval végeztük Saccharomyces cerevisiae sejtben . A kapott kromoszóma szekvenálása megerősítette a szintézis pontosságát. Prototípusként a M. genitalium G37 alfajt ( MG408 minta) használtuk fel, melynek patogén aktivitását speciális marker gátolta. A mesterséges genom azonosítására „vízjeleknek” nevezett nukleotidszekvenciákat vittek be a DNS-be [ 11 ] .
Bizonyos nehézségek merültek fel a szintetikus kromoszóma donor sejtből (élesztőből) a recipiens sejtbe történő átvitele során. Külön problémát jelentett az eredeti genom eltávolítása a baktériumsejtből, hogy azt szintetikusra cseréljék.
A további kísérletekben a M. genitalium baktériumokat , mint genetikai prototípust, rendkívül alacsony növekedési ütemük miatt el kellett hagyni. A 2010-ben végzett vizsgálatokban a Mycoplasma mycoides subsp. capri ( GM12 ) genomját használták prototípusként, és a Mycoplasma capricolum subsp . capricolum (CK) recipiensként .
Az élesztősejtből a recipiens sejtbe kromoszómák átvitelének technológiájának kidolgozása érdekében módszereket dolgoztak ki teljes kromoszómák klónozására élesztő centromer plazmidok formájában. A kísérletek tárgyaként a M. mycoides természetes kromoszómáját használtuk . Az M. mycoides kromoszóma M. capricolum sejtbe történő átvitelére tett első kísérletek azonban kudarccal végződtek. Mint kiderült, a probléma a baktériumsejt restrikciós rendszerben volt. A M. mycoides és a M. capricolum restrikciós rendszere megegyezik , DNS -ük metilált, és nincs probléma a kromoszóma közvetlen átvitelével egyik sejtből a másikba [12] . Az élesztőbe klónozott DNS nem metilálódik, és amikor M. capricolumba kerül, a restrikciós rendszer elpusztítja. Ennek elkerülése érdekében a donor DNS-t tisztított metilázzal vagy M. mycoides vagy M. capricolum kivonatával metilálták , vagy egyszerűen megsemmisítették a recipiens sejt restrikciós rendszerét [13] .
A második kísérlet a bakteriális genom szintetizálására 2010-ben történt. Prototípusnak a Mycoplasma mycoides ( capri GM12 alfaj) baktérium 1,08 millió nukleotidpár térfogatú kromoszómáját választották . Ennek a mesterséges genomnak a kódneve a JCVI-syn1.0. A munkához két genomot használtak: a CP001621 [14] ( GenBank adatbázis ), amelyet J. Glass csoportja szekvenált a Craig Venter Institute-ból 2007-ben [12] , és a CP001668 [15] transzgenikus genomot , amelyet a csoport szekvenált. Carol Lartik 2009-ben [13] . A CP001621 minta alapján kazettákat szintetizáltak és használtak további szintézishez. A CP001668 minta szekvenálásának végén egyeztetést végeztünk, amely 95 fragmentumban talált eltérést. A biológiailag jelentősnek talált eltéréseket a már szintetizált kazettákra korrigáltuk. 19 különbség, amely nem befolyásolja a baktérium létfontosságú aktivitását, változatlan maradt. A genom négy nem létfontosságú régiójában 4 WM1-WM4 tag képződik, amelyek hossza 1246, 1081, 1109 és 1222 pár. Az így létrejött M. mycoides JCVI syn1.0 génszekvencia CP002027 kóddal került be a GenBank adatbázisba [16] .