Számos biokémiai kapcsoló szabályozza az átmeneteket a sejtciklus különböző fázisai között és azokon belül . A sejtciklus összetett, rendezett, egymást követő események sorozata, amelyek szabályozzák egy sejt két sejtre való osztódását, és több különálló fázist foglal magában. A fázisok közé tartozik a G1 és G2 fázis, a DNS replikáció vagy az S fázis, valamint a sejtosztódás, mitózis vagy M fázis tényleges folyamata [1] . Az M fázis során a kromoszómák szétválnak, és citokinézis megy végbe.
A kapcsolók fenntartják a sejtciklus rendezett fejlődését, és ellenőrző pontként működnek annak biztosítására, hogy az egyes fázisok megfelelően fejeződjenek be, mielőtt a következő fázisra lépnének [1] . Például a Cdk vagy ciklin-dependens kináz a sejtciklus fő szabályozója, és lehetővé teszi a sejt számára, hogy G1-ből S-be vagy G2-ből M-be lépjen át azáltal, hogy foszfátot ad a fehérjeszubsztrátokhoz. Az ilyen többkomponensű (sok összekapcsolt fehérjét magában foglaló) kapcsolókról kimutatták, hogy döntő, megbízható (és potenciálisan visszafordíthatatlan) átmeneteket generálnak, és stabil oszcillációkat váltanak ki [2] . Ennek eredményeként aktív kutatás tárgyát képezik, és megpróbálják megérteni, hogy az ilyen összetett tulajdonságok hogyan kapcsolódnak a biológiai kontrollrendszerekhez [2] [3][4] .
Sok biológiai áramkör összetett kimeneteket állít elő egy vagy több visszacsatoló hurok felhasználásával . A biokémiai események sorozatában a visszacsatolás a szekvencia egy downstream elemére vonatkozik (B a szomszédos képen), amely befolyásolja valamelyik upstream komponenst (A a szomszédos képen), hogy befolyásolja saját termelését vagy aktiválását (kimenetét) a jövőben. Ha ez az elem saját teljesítményét növeli, akkor pozitív visszacsatolásban vesz részt (kék nyíl). A pozitív visszacsatoló hurkot önerősítő huroknak is nevezik, és lehetséges, hogy ezek a hurkok egy nagyobb hurok részét képezhetik, mivel ez a szabályozó áramkörökben általános [1] .
Ezzel szemben, ha ez az elem magasabb elemeken keresztül saját gátlásához vezet, az kanonikusan negatív visszacsatolás (piros tompa nyíl). A negatív visszacsatolási hurkot kiegyenlítő huroknak is nevezik, és gyakran láthatók olyan oszcillációk, amelyekben egy késleltetett negatív visszacsatoló jelet használnak a rendszer homeosztatikus egyensúlyának fenntartására [1] .
A visszacsatoló hurkok erősítésre (pozitív) vagy önkorrekcióra (negatív) használhatók. A pozitív és negatív visszacsatolások megfelelő kombinációja túlérzékenységet és bistabilitást generálhat [5] [6] , ami viszont kritikus átmeneteket és oszcillációkat generálhat.
A pozitív és negatív visszacsatolási hurkok nem mindig működnek jól. A biokémiai kapcsolók mechanizmusában együttműködve rugalmas rendszert hoznak létre. Például Pfeuty és Kaneko (2009) szerint a biokémiai rendszerek hiányának leküzdésére a pozitív visszacsatolású szabályozó hurkok kölcsönhatásba léphetnek a negatív szabályozó hurkokkal, hogy megkönnyítsék a stabil állapotból való felépülést [7] . Két stabil állapot együttélését bistabilitásnak nevezzük, ami gyakran a pozitív visszacsatolásos szabályozás eredménye.
Egy példa, amely felfedi több negatív és pozitív visszacsatolási hurok kölcsönhatását, a ciklin-függő protein kinázok vagy Cdks14 aktiválása. A pozitív visszacsatolási hurkok szerepet játszanak abban, hogy a sejteket alacsonyról magas Cdk-aktivitásra váltják. A kétféle hurok kölcsönhatása mitózisban nyilvánul meg. Míg a pozitív visszacsatolás elindítja a mitózist, a negatív visszacsatolási hurok elősegíti a ciklinfüggő kinázok inaktiválását az anafázis-stimuláló komplex által. Ez a példa egyértelműen bemutatja a pozitív és negatív visszacsatolás kombinált hatásait a sejtciklus szabályozására.
Az ingerre adott mindent vagy semmit választ túlérzékenységnek nevezzük . Más szóval, az inger nagyon kis változása nagyon nagy változást okoz a válaszban, ami szigmoidális dózis-válasz görbét hoz létre. A túlérzékeny választ a Hill -egyenletként ismert V = S n /(S n + K m ) általános egyenlettel írjuk le , amikor n, a Hill-együttható nagyobb, mint 1. A szigmoid görbe meredeksége az értéktől függ. n. Az n = 1 érték hiperbolikus vagy Michael-választ ad. Az ultraérzékenységet különféle rendszerekben érik el; figyelemre méltó példa az enzim hemoglobinjának kooperatív kötődése szubsztrátjához. Mivel a túlérzékeny válasz szinte „digitális”, felhasználható az ingerre adott válasz fokozására vagy hirtelen, hirtelen átmenetre ("ki" és "be" állapotok között).
Az ultraérzékenység fontos szerepet játszik a sejtciklus szabályozásában. Például a Cdk1 és a Wee1 a mitózis szabályozói, és képesek egymást inaktiválni a gátló foszforiláció révén. Ez egy kettős negatív visszacsatolási hurok, amelyben mindkét szabályozó inaktiválja egymást. Kim és munkatársai (2007) szerint egy ultraérzékeny elemnek kell lennie a bistabil válasz létrehozásához. Kiderült, hogy a Wee1 túlérzékeny választ ad a Cdk1-re, és ez valószínűleg a Wee1 különböző foszforilációs helyek közötti szubsztrát-versenyéből adódik [8] .
A bistabilitás hiszterézist , a hiszterézis pedig multistabilitást jelent. A multistabilitás két vagy több stabil állapot jelenlétét jelzi egy adott bemenethez. Ezért a bistabilitás egy rendszer azon képessége, hogy két stacionárius állapotban létezzen [9] . Más szóval, van egy sor ingerérték, amelyre egy válasznak két állandósult állapotú értéke lehet. A bistabilitást hiszterézis kíséri , ami azt jelenti, hogy a rendszer előzményeitől függően előnyösen megközelíti a két stabil állapot egyikét. A bistabilitáshoz visszacsatolás, valamint ultraérzékeny áramköri elem szükséges.
Megfelelő körülmények között a pozitív és negatív visszacsatolási hurkok feltételeket biztosíthatnak a bistabilitáshoz; például az áramkör ultraérzékeny válaszeleméhez kapcsolódó pozitív visszacsatolás miatt. A hiszteretikus bistabil rendszer megbízható reverzibilis kapcsolóként működhet, mivel a rendszer nehezebben vált át a "be" és "ki" állapotok között (az egyenértékű monostabil túlérzékeny válaszhoz képest). A rendszer úgy is konfigurálható, hogy az egyik átmenet fizikailag elérhetetlen legyen; például semmilyen mértékű ingercsökkentés nem állítja vissza a rendszert "kikapcsolt" állapotba, ha már "be" állapotban van. Ez egy megbízható visszafordíthatatlan kapcsolót képez. Egy egyszerű biológiai kapcsoló megtervezésének módját egy konferencia előadás ismerteti [10] .
A hálózati topológiák között nincs egy-egy megfelelés, mert sok hálózatnak hasonló be- és kilépési kapcsolatai vannak. A hálózati topológia nem jelent bemenetet vagy kimenetet, és hasonlóképpen a bemenet vagy a kimenet nem tartalmaz hálózati topológiát. Ez az oka annak, hogy a paraméterezés nagyon fontos az áramkör működéséhez. Ha a bemenet dinamikája összemérhető vagy gyorsabb, mint a rendszer válasza, a válasz hisztérikusnak tűnhet.
Az alábbiakban három olyan sejtciklus-kapcsolót ismertetünk, amelyek hirtelen és/vagy visszafordíthatatlan átmeneteket biztosítanak a fent leírt mechanizmusok némelyikének használatával.
A G1/S átmenet , ismertebb nevén az ellenőrzőpont a bimbózó élesztőben (restrikciós pont más szervezetekben), szabályozza a sejtciklus lefolyását [1] . Ezen az ellenőrző ponton a sejtek vagy leállnak a DNS replikációja előtt (tápanyag-korlátozás vagy feromon jel miatt), meghosszabbítják a G1-et (méretkontroll), vagy megkezdik a replikációt, és végigmennek a sejtciklus hátralevő részén. A bimbózó élesztőben a G1/S szabályozóhálózat vagy regulon magában foglalja a G1 Cln1, Cln2 és Cln3 ciklineket, a Cdc28-at (Cdk1), az SBF és MBF transzkripciós faktorokat, valamint a Whi5 transzkripció inhibitort [2] . A Cln3 kölcsönhatásba lép a Cdk1-gyel, és események sorozatát indítja el a célpontok széles körének foszforilálásával, beleértve az SBF-et, MBF-et és a Whi5 -öt . A Whi5 foszforilációja kimozdítja a sejtmagból, megakadályozva, hogy az SBF és az MBF gátolja. Az aktív SBF/MBF mozgatja a G1/S átmenetet, beleértve a B-típusú ciklineket, és elindítja a DNS-replikációt, a rügyképződést és az orsó-duplikációt. Ezenkívül az SBF / MBF szabályozza a Cln1 és Cln2 expresszióját, amelyek szintén kölcsönhatásba léphetnek a Cdk1-gyel, hogy elősegítsék a célpontjai foszforilációját.
Erről a G1/S kapcsolóról eredetileg úgy gondolták, hogy lineáris eseménysorozatként működik, amely a Cln3-tól kezdődik és az S fázisig végződik [11] . Azonban az a megfigyelés, hogy bármelyik Clns elegendő volt a regulon aktiválásához, azt jelzi, hogy a Cln1 és a Cln2 képes lehet pozitív visszacsatolást használni saját transzkripciójának aktiválására. Ez egy folyamatosan gyorsuló ciklust eredményezne, amely visszafordíthatatlan bistabil flip-flopként működhet [2] . Scotheim és munkatársai egysejtes méréseket használtak bimbózó élesztőben annak bizonyítására, hogy ez a pozitív visszacsatolás valóban megtörténik [2] . Kis mennyiségű Cln3 indukálja a Cln1/2 expresszióját, majd egy visszacsatolási hurok lép működésbe, ami a Whi5 gyors és hirtelen kilépéséhez vezet a sejtmagból, és ennek következtében a G1/S regulon gének koherens expressziójához. Koherens génexpresszió hiányában a sejtek hosszabb ideig tartanak a G1-ből való kilépéshez, és jelentős részük még az S fázis előtt is leáll, ami rávilágít a pozitív visszacsatolás fontosságára a G1/S váltás fokozásában.
A G1/S sejtciklus-ellenőrzőpont szabályozza az eukarióta sejtek átmenetét a G1 rés első fázisából a DNS-szintézis fázisba, az S-be. Az emlőssejtekben ebben a váltásban két sejtciklus-kináz van, amelyek segítik az ellenőrzőpont szabályozását: sejtciklikus. a CDK4/6-ciklin D és CDK2-ciklin E kinázok [1] . Egy Rb-t és E2F-et tartalmazó transzkripciós komplex fontos ennek az ellenőrzőpontnak a szabályozásához. Az első gap fázisban az Rb-HDAC represszor komplex kötődik az E2F-DP1 transzkripciós faktorokhoz, ezáltal gátolja a downstream transzkripciót. Az Rb CDK4/6 és CDK2 általi foszforilációja disszociálja az Rb-represszor komplexet, és sejtciklus-kapcsolóként szolgál. Az Rb foszforilációja után az E2F transzkripciós aktivitásának gátlása megszűnik. Ez lehetővé teszi az S-fázisú gének transzkripcióját, amelyek olyan fehérjéket kódolnak, amelyek fokozzák a G1 átállását az S-fázisba.
Számos különböző ingert használnak az ellenőrzőpontok szabályozására, beleértve a TGFb-t, a DNS-károsodást, az érintkezésgátlást, a replikációs öregedést és a növekedési faktorok megvonását. Az első négy a sejtciklus-kináz inhibitorok INK4 vagy Kip/Cip családjának tagjait indukálja. A TGFb gátolja a Cdc25A, a sejtciklus-kinázokat aktiváló foszfatáz transzkripcióját, és a növekedési faktor eltávolítása aktiválja a GSK3b-t, amely foszforilálja a ciklin D-t. Ez gyors ubikvitinációjához vezet [12] .
A G2 a ciklin A E2F által közvetített transzkripciójával kezdődik, amely a ciklin A-Cdk2 komplexet képezi. A mitózishoz való továbblépéshez a ciklin B - Cdk1 komplexet (először az MPF-hez vagy M-fázishoz hozzájáruló faktorként fedezték fel; a Cdk1 a hasadó élesztőben Cdc2-ként, a bimbózó élesztőben a Cdc28 néven is ismert) a Cdc25 fehérje-foszfatáz által aktiválódik [ 1 . ] . Amikor a mitózis elkezdődik, a magburok felbomlik, a kromoszómák lecsapódnak és láthatóvá válnak, a sejt pedig felkészül az osztódásra. A ciklin B -Cdk1 aktivációja a sejtmag membránjának pusztulásához vezet, ami jellemző a mitózis beindulására [1] .
A ciklin B-Cdk1 komplex egy szabályozó körben vesz részt, amelyben a Cdk1 képes foszforilálni és aktiválni aktivátorát, a Cdc25-öt (pozitív visszacsatolás), valamint foszforilálni és inaktiválni inaktivátorát, a Wee1 kinázt (kettős negatív visszacsatolás) [1] . Ez az áramkör bistabil flip-flopként [13] működhet, egy állandósult állapottal a G2-ben (Cdk1 és Cdc25 kikapcsolva, Wee1 bekapcsolva) és egy második állandó állapottal az M fázisban (Cdk1 és Cdc25 aktív, Wee1 kikapcsolva). Magát a Wee1-et azonban más tényezők, például a Cdr2 szabályozzák .
Ezt Jin és munkatársai javasolták és védték. [14] a humán HeLa sejtvonallal 1998-ban végzett kísérletsorozatuk során kimutatták, hogy a ciklin B sejten belüli térbeli elrendeződése indítja el a mitózist. Amint az emberi sejtekkel és tengeri csillag petesejtekkel végzett korábbi kísérletekből ismert, Jin et al. összefoglalva, hogy a ciklin B1 bőségesen van jelen a citoplazmában a mitózis nem osztódó fázisaiban, de a sejtmagban a Cdk1-gyel komplexben azonosítható közvetlenül azelőtt, hogy a sejt mitózisba lépne. Más kísérletezők kimutatták, hogy a sejtek nem osztódnak, ha a ciklin B a citoplazmában marad. A ciklin B térbeli helyzetének a sejtosztódásra és a ciklus szabályozására gyakorolt hatásának további vizsgálatára Jin et al. nukleáris lokalizációs jellel (NLS) jelölt ciklin B-t, amely a ciklint a sejtmagban tartja. Kezdetben ez a ciklin B NLS nem váltotta ki a várt hatást, a mitózisba való felgyorsult bejutást. Ez az eredmény az alábbi ábrán látható gátlásnak köszönhető. A Wee1, a ciklin B-Cdk1 komplex inhibitora, a sejtmagban lokalizálódik, és valószínűleg foszforilálja a ciklin B NLS-t, így az nem képes megfelelően működni. Ezt a posztulátumot megerősítették, amikor Jin et al. Cdc2AF-et, a Cdk1 nem foszforilált mutánsát használta, és a ciklin B sejtmagban történő lokalizációja miatt felgyorsult sejtosztódást figyeltek meg. Ezért a ciklin B nukleáris lokalizációja szükséges, de nem elegendő a sejtosztódás kiváltásához.
A sejtciklus szabályozásával foglalkozó tanulmányban Jin et al. manipulált sejteket, hogy felmérjék a ciklin B lokalizációját a DNS-károsodást szenvedő sejtekben. A DNS-károsodás és az exogén ciklin B nukleáris lokalizációja kombinációjával meg tudták állapítani, hogy a sejtek még DNS-károsodás esetén is osztódnának, ha a ciklin B-t a sejtmagban kényszerítenék expresszálódásra. Ez azt jelzi, hogy a ciklin B térbeli lokalizációja a mitózis ellenőrző pontját töltheti be. Ha a sejtek normális esetben nem osztódnak, amikor genetikai információik sérültek, de mitózisba lépnek, ha endogén ciklin B expresszálódik a sejtmagban, akkor valószínű, hogy a ciklin B citoplazmába történő transzlokációja az a mechanizmus, amely megakadályozza az éretlen mitotikus bejutást. Ezt a hipotézist Jin et al. A G2-ben a DNS-károsodás miatt visszatartott sejtek elemzése. Ezekben a sejtekben Jin és mtsai. a ciklin B-Cdc2 komplex magas szintű aktivitását figyelték meg a citoplazmában. Ez megerősíti a korábban említett elméletet, mivel azt mutatja, hogy a Cdc2 képes aktiválni a ciklint anélkül, hogy azonnal a sejtmagba kerülne. Emellett a ciklin B-Cdk1 komplexek felhalmozódása a DNS-károsodás miatt nem osztódó sejtek citoplazmájában alátámasztja azt az elméletet, hogy a ciklin B nukleáris lokalizációja indítja el a mitotikus bejutást.
Így a ciklin B térbeli lokalizációja szerepet játszik a mitózisba lépésben. A ciklin B transzlokációja a citoplazmából a sejtmagba szükséges a sejtosztódáshoz, de nem elegendő, mivel gátlói nem engedik, hogy a sejt idő előtt mitózisba kerüljön. A ciklin B-Cdk1 komplex gátlásának fenntartása mellett a korai sejtosztódást maga a ciklin B transzlokációja is megakadályozza. A ciklin B-Cdk1 komplex a DNS-sérült sejtekben a citoplazmában marad, nem pedig a sejtmagba költözik, megakadályozva a sejt nem gátolja a sejt mitózisba való belépését. Az ezen a területen kutatók által feltett következő kérdés az, hogy milyen konkrét mechanizmus szabályozza ezt a transzlokációt.
Santos és munkatársai [15] azt sugallták, hogy a ciklin B transzlokációt egy pozitív visszacsatolási mechanizmus szabályozza, amely hasonló ahhoz, amely a ciklin B-Cdk1 komplex aktiválását szabályozza. Úgy vélték, hogy a pozitív visszacsatolási hurok magában foglalja a ciklin B foszforilációját és transzlokációját a sejtmagba. Ennek feltárásához először megerősítették Jin és munkatársai néhány eredményét. kísérletek immunfluoreszcenciával mutatták ki a ciklin B-t a citoplazmában az osztódás előtt, és transzlokációt a sejtmagba a mitózis elindítására, amit használtak, összehasonlítva a nukleáris burok megszakításával (NEB). A Wee1 vagy Myt1 által nem inaktiválható nukleáris ciklin felhasználásával Santos és munkatársai megfigyelték, hogy az aktív nukleáris ciklin több ciklint toboroz a citoplazmából, hogy a sejtmagba kerüljön. Ezt a megfigyelést megerősítették rapamicinnel végzett iRap kezeléssel. Az iRap indukálja a jelölt ciklin B transzlokációját a citoplazmából a sejtmagba. Nevezetesen, Santos et al. láttuk, hogy a jelöletlen ciklin B vándorol a ciklin B-vel az iRap hatására. A jelöletlen ciklin nem reagál a kezelésre, és a kezelt ciklintől függetlenül mozog. Ez megerősíti a pozitív visszacsatolási hurok első részét, miszerint a ciklin B nukleáris lokalizációja, amely mitotikus bejutáshoz vezet, elősegíti a citoplazmatikus ciklin B fokozott transzlokációját a sejtmagba, ami tovább segíti a megmaradt citoplazmatikus ciklin B vándorlását a sejtmagba stb. .
Santos és munkatársai továbbá azt sugallják, hogy a ciklin B foszforilációja a pozitív visszacsatolási hurok másik összetevője. Észrevették, hogy a ciklin B természetesen a NEB előtt kerül be a sejtmagba. Ezzel szemben a mutált, nem foszforilált ciklin B a NEB során belép a sejtmagba. Ez meglepő, mivel a sejtciklusra jellemző, hogy a ciklin a NEB előtt a sejtmagba költözik, hogy a sejtciklus mitotikus osztódásba kerüljön. Így Santos és mtsai. arra a következtetésre jutottak, hogy a ciklin B foszforilációja elősegíti a sejtmagba való transzlokációt. Emellett azonban a sejtmagba való transzlokáció elősegíti a ciklin foszforilációját. A szerzõk megjegyzik, hogy a magban a ciklin B foszforilációja tizenkilencszer kedvezõbb, mint a citoplazmában a mag kisebb össztérfogata miatt, ami nagyobb arányú foszforilációt biztosít. A foszforiláció következtében megnövekedett transzlokáció és a transzlokáció következtében megnövekedett foszforiláció egy pozitív visszacsatolási hurkot illusztrál, amely hasonlít a korábban felfedezett ciklin B-Cdk1 komplexet aktiválóhoz.
Összefoglalva, a ciklin B nukleáris lokalizációja szükséges a sejt mitózisba való belépéséhez. A sejtosztódást biztosító ciklin citoplazmából a sejtmagba történő transzlokációját pozitív visszacsatolási hurok szabályozza. Az aktív ciklin B beköltözik a sejtmagba, és elősegíti a sejtmagban található további ciklin egységek aktiválódását és mozgását. Ez a jelenség fokozott, ha a foszforilációt vizsgáljuk. A ciklin B foszforilációja elősegíti a nukleáris transzlokációt, és a sejtmagban lévő ciklin B sokkal nagyobb valószínűséggel foszforilálódik, így a nukleáris lokalizáció elősegíti a ciklin B foszforilációját.
Amint a sejtek mitózisban vannak, a ciklin B-Cdk1 aktiválja az anafázis-stimuláló komplexet (APC), amely viszont a ciklin B lebontásával inaktiválja a ciklin B-Cdk1-et, ami végül a mitózisból való kilépéshez vezet. A Cdk1 bistabil válaszfüggvényének és az APC negatív visszacsatolásának kombinációja az úgynevezett relaxációs oszcillátort [3] generálhatja a Cdk1 aktivitás éles kitöréseivel, amelyek stabil mitotikus ciklusokat indítanak el. A relaxációs oszcillátorban azonban a szabályozási paraméter lassan mozog a rendszer válaszdinamikájához képest, ami lehet a mitotikus bemenet pontos reprezentációja, de nem feltétlenül a mitotikus kimenet.
A sejtciklus mitotikus szakaszából való kilépéshez a ciklin B-Cdk1 komplexet inaktiválni kell. A sejtek ezután visszatérhetnek a G1 rés első fázisába, és megvárhatják, amíg a ciklus újra folytatódik.
2003-ban Pomerening et al. erős bizonyítékot szolgáltatott erre a hipotézisre azáltal, hogy kimutatta a Cdk1 aktiváció hiszterézisét és bistabilitását Xenopus oociták citoplazmatikus kivonatában [3] . Először a Cdk1 időszakos tüske-válaszát mutatták ki a nem lebontható Cyclin B koncentrációjának változására (hogy leválasztsák a Cdk1 válaszhálózatot az APC által közvetített negatív visszacsatolásról). Azonban egy ilyen válasz megfelel mind a monostabil szuperérzékeny átmenetnek, mind a bistabil átmenetnek. E két lehetőség megkülönböztetésére a változó ciklinszintekre reagálva mérték az aktív Cdk1 steady-state szintjét, de két külön kísérletben az egyik egy interfázisos kivonattal, a másik pedig egy már mitózisban lévő kivonattal indult. A ciklin köztes koncentrációinál az aktív Cdk1 két stacioner koncentrációját találták. Az, hogy a két stacionárius állapot közül melyiket foglaltuk el, a rendszer történetétől függött, vagyis attól, hogy interfázisos vagy mitotikus kivonattal indultak-e ki, ami gyakorlatilag hiszterézist és bistabilitást mutat.
Ugyanebben az évben Sha és munkatársai [16] egymástól függetlenül ugyanerre a következtetésre jutottak, hiszterézis hurkot találva Xenopus laevis tojáskivonatokat is felhasználva. Ebben a cikkben a Nowak-Tyson modell három előrejelzését tesztelték annak megállapítására, hogy a hiszterézis a "sejtciklus-átmenetek mitózisba és onnan kifelé" hajtóereje. A Nowak-Tyson modell előrejelzései minden nyeregpont-elágazásnál közösek. A nyeregpont-elágazások rendkívül hasznosak egy tökéletlen világban, mert segítenek leírni a tökéletlen biológiai rendszereket. Az első előrejelzés az volt, hogy a ciklinnek a mitózisba való belépésének küszöbkoncentrációja magasabb, mint a ciklinnek a mitózisból való kilépéshez szükséges küszöbkoncentrációja, és ezt megerősítette a ciklikus tojáskivonatok nem lebontható ciklin B-vel való kiegészítése, valamint az aktiválási és inaktivációs küszöbérték mérése. cikloheximid (CHX) hozzáadása, amely a fehérjeszintézis gátlója [1] . Emellett a Nowak-Tyson modell második jóslata is beigazolódott: a nem replikálódott dezoxiribonukleinsav, vagyis DNS növeli a ciklin küszöbkoncentrációját, amely a mitózisba való belépéshez szükséges. Ahhoz, hogy ezt a következtetést levonjuk, CHX-et, APH-t (DNS-polimeráz inhibitor) vagy mindkettőt, valamint nem lebontható ciklin B-t adtunk a citosztatikus faktor által felszabaduló kivonatokhoz. A harmadik és egyben utolsó jóslat, amelyet ebben a cikkben teszteltünk és megerősítünk, az volt, hogy a Cdc2 aktiváció sebessége lelassul a ciklinaktiváció küszöbkoncentrációja közelében. Ezek az előrejelzések és kísérletek a kapcsoláshoz hasonló kapcsolási viselkedést mutatnak be, amely dinamikus rendszerben hiszterézissel írható le [17] .
A metafázisból az anafázisba való átmenet során rendkívül fontos, hogy a testvérkromatidák helyesen és egyidejűleg váljanak szét a sejt ellentétes végeire [1] . A testvérkromatid elválasztás kezdetben erősen gátolt, hogy megakadályozzák a korai szétválást a késői mitózisban, de ezt a gátlást gyengíti az anafázis stimuláló komplex (APC) gátló elemek elpusztítása, ha a testvérkromatid biorientációt elérjük. Az egyik ilyen gátló elem a securin , amely megakadályozza a kohézin , a testvérkromatidokat összetartó komplex elpusztulását azáltal, hogy egy proteáz - szeparázhoz kötődik , amely a kohézin komplex egyik alegységét, az Scc1-et veszi célba a megsemmisítés érdekében. Ebben a rendszerben a Cdc14 foszfatáz képes eltávolítani a gátló foszfátot a securinból, ezáltal elősegítve az APC securin lebomlását a szeparáz felszabadításával. Amint azt Uhlmann és munkatársai kimutatták, a kromoszómák mitotikus orsóhoz való kapcsolódása során a kromatidák párban maradnak, mivel a testvérek közötti kötés megakadályozza a szétválást [8] [18] . A kohézió a DNS-replikáció során jön létre, és a kohézintől függ, amely egy több alegységből álló komplex, amely Scc1-ből, Scc3-ból, Smc2-ből és Smc3-ból áll. Az élesztőben a metafázisból az anafázisba való átmenet során az Scc1 disszociál a kromoszómákról, és a testvérkromatidák elkülönülnek. Ezt a hatást az Esp1 fehérje szabályozza, amely szorosan kötődik a Pds1 anafázis inhibitorhoz, amelyet az anafázis-stimuláló komplex lebont. Annak ellenőrzésére, hogy az Esp1 valóban szerepet játszik-e az Scc1 kromoszóma-asszociáció szabályozásában, a sejttörzseket a G1-nél alfa-faktorral leállítottuk. Ezek a sejtek a fejlesztés során letartóztatott állapotban maradtak. Mutáns Esp1-1 sejteket használtunk, és a kísérletet megismételtük, az Scc1 sikeresen kötődött a kromoszómákhoz, és a szintézis leállása után is asszociált maradt. Ez fontos volt annak bizonyításához, hogy az Esp1 esetén az Scc1 képessége, hogy stabilan kapcsolódjon a kromoszómákhoz a G1 során, akadályozott, és az Esp1 valóban képes eltávolítani az Scc1-et a kromoszómákból.
Ezt Holt et al. [4] , hogy a szeparáz aktiválja a Cdc14-et, amely viszont a securinra hat, így pozitív visszacsatolási hurkot hoz létre, amely javítja a metafázis-anafázis közötti átmenet tisztaságát és a testvérkromatidok elválasztásának koordinációját [19] . Holt és munkatársai a securin foszforilációra gyakorolt pozitív visszacsatolási hatás alapjait vizsgálták mutáns securin élesztőtörzsek felhasználásával, és megvizsgálták, hogy a securin foszforszabályozásában bekövetkező változások hogyan befolyásolják a testvérkromatid elválasztás szinkronját. Eredményeik azt mutatják, hogy a securin-szeparase-cdc14 pozitív hurokkal való interferencia csökkenti a testvérkromatid elválasztás szinkronját. Ez a pozitív visszacsatolás feltételezhetően bistabilitást generálhat az anafázisba való átmenet során, ami arra készteti a sejtet, hogy visszafordíthatatlan döntést hozzon a testvérkromatidák szétválasztása mellett.
A mitózisból való kilépés egy fontos átmeneti pont, amely a mitózis végét és egy új G1 fázis kezdetét jelzi a sejt számára, és a sejtnek specifikus szabályozási mechanizmusokra kell támaszkodnia, hogy a mitózisból való kilépés után soha ne térjen vissza a mitózisba, amíg meg nem teljes. Sikerült a G1, S és G2 szakaszokon, és minden szükséges ellenőrzőponton. Számos tényező, köztük a ciklinek , a ciklinfüggő kinázok (CDK-k), az ubiquitin ligázok , a ciklinfüggő kinázok inhibitorai és a reverzibilis foszforiláció szabályozza a mitotikus kilépést annak biztosítására, hogy a sejtciklus eseményei a megfelelő sorrendben, a legkevesebb hibával történjenek [20] . A mitózis végét az orsó szétesése, a kinetochore mikrotubulusok lerövidülése , valamint az asztrális (nonkinetochore) mikrotubulusok kifejezett kinövése jellemzi [21] . Egy normál eukarióta sejt esetében a mitózisból való kilépés visszafordíthatatlan [22] .
Számos javaslat született a sejt által a mitózisból való kilépés visszafordíthatatlanságának biztosítására használt szabályozó mechanizmusokkal kapcsolatban egy modell eukarióta szervezetben, a Saccharomyces cerevisiae bimbózó élesztőben . A sejtciklus-szabályozók proteolitikus lebomlását és a ciklin-függő kinázok szintjére gyakorolt megfelelő hatást olyan mechanizmusként javasolták, amely elősegíti az eukarióta sejtciklust, és különösen a metafázisból az anafázisba való átmenetet. Ebben az elméletben az anafázis stimuláló komplex (APC), az ubiquitin ligáz egy osztálya, elősegíti a mitotikus ciklinek (Clb2) és az anafázis gátló faktorok (PDS1, CUT2) lebomlását, hogy elősegítse a mitotikus kilépést [23] . Az APC ubiquitinál egy kilenc aminosavból álló motívumot, amelyet megszakító dobozként (D-box) ismernek a mitotikus ciklinek NH2-terminális doménjében a proteaszóma lebontás érdekében [23] . Az APC a Cdc20 -zal együtt (APC-Cdc20) ubiquitinálja és célozza meg a mitotikus ciklineket (Clb2) a kezdeti fázisban történő lebontás érdekében. Ezzel egyidejűleg az APC-Cdc20 közvetíti a securinok lebomlását, amelyek gátolják a szeparázokat azáltal, hogy az anafázis korai szakaszában kötődnek. A felszabaduló és aktív szeparáz lehasítja a kohézint, amely összetartja a testvérkromatidokat, megkönnyítve a testvérkromatidok szétválását és beindítja a mitotikus kilépést, elősegítve a Cdc14 felszabadulását a sejtmagból [24] [25] . Egy későbbi fázisban a Cdk1 leszabályozása és a Cdc14, a Cdh1-et aktiváló foszfatáz aktiválása elősegíti az APC képződését a Cdh1-gyel (APC-Cdh1) kapcsolatban a Clb2 lebontására [22] . A Cdc20 és Cdh1, amelyek APC aktivátorok, olyan szubsztrátokat toboroznak, mint a securin és a B-típusú ciklinek (Clb) az ubikvitinációhoz [26] . Az orsó dinamikájában részt vevő fehérjék, például az Sli15, Ase1 és Ask1 Cdk1-Clb2 komplexei nélkül az orsó megnyúlása és kromoszóma szegregációja biztosított, ami megkönnyíti a mitózisból való kilépést [22] . A proteolitikus degradáció jelentősége az eukarióta sejtciklusban megváltoztatta a sejtosztódásról, mint egyszerű kinázkaszkádról alkotott nézetet, egy bonyolultabb folyamatra, amely kölcsönhatást igényel a foszforiláció, az ubikvitináció és a proteolízis között [23] . A cdc28-as1, egy INM-PP1 (ATP analóg) érzékeny Cdk alléllal rendelkező bimbózó élesztősejtekkel végzett kísérletek azonban bebizonyították, hogy a B-típusú ciklinek (Clb) elpusztítása nem szükséges a mitózisból való visszafordíthatatlan kilépéshez [22] . A Clb2 lebomlása lerövidíti az irreverzibilis mitotikus kilépés kiváltásához szükséges Cdk1 gátlás időtartamát, ami azt jelzi, hogy a ciklin proteolízis hozzájárul az eukarióta sejtciklus dinamikus természetéhez lassabb hatásideje miatt, de nem valószínű, hogy ez a fő meghatározó tényező az irreverzibilis kilépés kiváltásában. sejtciklus.. átmenetek [22] .
Felfedezések születtek, amelyek jelzik a ciklin-dependens kinázok inhibitorszintjének fontosságát az eukarióta sejtciklus szabályozásában. Konkrétan kimutatták, hogy a Sic1 szintje , amely a Clb-CDK komplexek sztöchiometrikus gátlója a bimbózó élesztőben, különösen fontos az irreverzibilis G1-S átmenethez az S-fázisú kinázok irreverzibilis aktiválása miatt [27] . Kimutatták, hogy a Sic1 szint fontos szerepet játszik a mitózisból való visszafordíthatatlan kilépés kiváltásában (M-G1 átmenet), valamint a G1-S átmenetben. A mitózis során a Cdk1-szint csökkenése a Cdc14 aktiválásához vezet, egy foszfatázhoz, amely a Cdh1 és Swi5, a Sic1 fehérjék transzkripciós aktivátora révén ellensúlyozza a Cdk1-et [28] . Míg a Sic1 lebomlása egy bizonyos alacsony szintre S-fázisot váltott ki, addig a Sic1 felhalmozódása egy bizonyos magas szintre volt szükséges ahhoz, hogy a mitózisból visszafordíthatatlan kilépést váltson ki [22] . A Cdk1 inhibitorok még akkor is képesek mitotikus kilépést indukálni, ha a B-típusú ciklinek lebomlását a nem lebontható Clbs vagy proteaszóma inhibitorok expressziója gátolja. A testvérkromatidák azonban nem szegregálódnak, és a sejtek visszatérnek a mitózisba az inhibitorok kimosása után, ami azt jelzi, hogy az inhibitorok küszöbértékét el kell érni ahhoz, hogy a ciklin lebomlásátöl függetlenül visszafordíthatatlan mitotikus kilépés induljon el [29] . Annak ellenére, hogy a G1-S átmenethez képest eltérő Sic1 szint küszöbök szükségesek a mitotikus kilépés kiváltásához, a Sic1 szintről kimutatták, hogy kulcsszerepet játszik az eukarióta sejtciklus szabályozásában a CDK aktivitás gátlásával.
Mivel az eukarióta sejtciklus számos fehérjét és szabályozó kölcsönhatást foglal magában, dinamikus rendszerszemléletű megközelítéssel egyszerűsíthető az összetett biológiai lánc egy közös szerkezetté a jobb elemzés érdekében [30] . A négy lehetséges bemeneti/kimeneti kapcsolat közül úgy tűnik, hogy a Sic1 szint és a mitotikus kilépés közötti kapcsolat egy irreverzibilis bistabil kapcsoló jellemzőit mutatja, amelyet az APC-Cdh1, Sic1 és Clb2-Cdk1 közötti visszacsatolás hajt [22] . A bistabilitásról ismert, hogy szabályozza az olyan biológiai funkciókat, mint a sejtciklus szabályozása és a sejtdifferenciálódás, és kulcsszerepet játszik számos sejtszabályozó hálózatban [31] . A bistabil bemeneti/kimeneti kapcsolatot két stabil állapot jellemzi két bifurkációs ponttal. Egy adott bejáratnál több kijárat is lehetséges a két bifurkációs ponttal jelölt bistabilitási tartományban. Ezenkívül a bistabil csatolás hiszterézist mutat: a végső állapot/kimenet függ a bemenet történetétől, valamint a bemenet aktuális értékétől, mivel a rendszernek van memóriája [32] . Az egyik bifurkációs pontban a vezérlő paraméter negatív értéke van (a bifurkációs pont a tengely másik oldalán van), ami a két stabil állapot közötti réshez és az egyik állapotból a másikba való átmenet visszafordíthatatlanságához vezet. A mitózisból való kilépés tekintetében a két stabil állapotot a mitózis és a G1 fázis határozza meg. Amint a Sic1 (bemenet) szintje meghaladja a küszöböt, visszafordíthatatlan átmenet következik be a mitózisból (I. stabil állapot) a G1 fázisba (II. stabil állapot). Tökéletlen környezetben az egyetlen elágazás, amely változatlan marad, a nyereg-csomópont bifurkáció . A nyereg-csomópont bifurkáció nem sérül (a nyereg-csomópont az elvárt általános viselkedés), míg a transzkritikus és villás bifurkáció nem sérül tökéletlenségek jelenlétében [33] . Így az egyetlen egydimenziós bifurkáció, amely egy tökéletlen biológiai világban létezhet, a nyereg-csomópont bifurkáció [32] . Az M-G1 átmenet és a Sic1 szint közötti bistabil kapcsolat két nyereg-csomópont bifurkáció diagramjaként ábrázolható, amelyben a rendszer viselkedése minőségileg megváltozik a vezérlőparaméter, a Sic1 értékének kis változásával.
Mivel a sejtciklus viselkedése kritikusan függ a Sic1 mennyiségétől az M-G1 átmeneti állapotban, a Sic1 mennyiségét a rendszerszintű visszacsatolás szigorúan szabályozza. Mivel a Cdk1-Clb2 gátolja a Sic1-et azáltal, hogy foszforilálja a Sic1-et, és elérhetővé teszi a Sic1-et az ubikvitináció útján történő lebontáshoz, a Cdk1-Clb2 APC-Cdh1-függő lebomlása nemcsak a rendelkezésre álló Cdk1-Clb2 komplexek szintjét csökkenti, hanem növeli a Sic1 szintjét is. viszont még jobban gátolja a Cdk1-Clb2 működését [28] . Ezt a kettős negatív visszacsatolási hurok aktivációt a Cdk1-Clb2 APC-Cdc20-függő degradációja és a Cdc14 felszabadulása indítja el a nukleoláris Net1/Cfi1 fehérjéből [34] . A FEAR (anaphase early release of Cdc14) útvonal elősegíti a Clb2-Cdk1-függő Net1 foszforilációt, amely átmenetileg felszabadítja a Cdc14-et a Net1-ből [35] . A felszabaduló Cdc14 és Clb2-Cdk1 komplexek átjutnak az orsóba, ami aktiválja a mitóziskilépési hálózatot (MEN). A MEN biztosítja a Cdc14 tartós felszabadulását a sejtmagból [35] , a Cdc14 pedig ellensúlyozza a Clb2-Cdk1 aktivitást a Cdh1 aktiválásával és a Sic1 stabilizálásával a Sic1 transzkripciós aktivátor Swi5 aktiválásával [36] . A Sic1 pozitívan szabályozza önmagát a Cdk1-Clb2 gátlásával az Swi5 gátlás felszabadítása érdekében, és a Cdh1 szintén pozitívan szabályozza magát a Clb2-Cdk1 gátlásával, hogy felszabadítsa a MEN gátlást, ami aktiválhatja a Cdc14-et, majd magát a Cdh1-et. Az APC-Cdh1 és Sic1 által alkotott kettős negatív visszacsatolási hurok szükséges az alacsony Clb2-Cdk1 aktivitás fenntartásához, mivel a Clb2 automatikusan aktiválja szintézisét a transzkripciós faktorok, az Fkh2-Mcm1 Ndd1 komplex aktiválásával [28] .
Az eukarióta sejtciklus különböző ellenőrző pontokból és visszacsatolási hurkokból áll, amelyek biztosítják a megfelelő és sikeres sejtosztódást. Például mitózis során, amikor a duplikált kromoszómák nem megfelelően kapcsolódnak a mitotikus orsóhoz, az orsó összeállítási ellenőrzőpont (SAC) fehérjék, köztük a Mad és a Bub, gátolják az APC-Cdc20-at, késleltetve az anafázisba való belépést és a B-típusú ciklin lebomlását. Ezen túlmenően, ha a mitotikus orsók elmozdulnak, a MEN-t, majd a Cdc14-et a Bub2 és Bfa1-függően gátolja, hogy megakadályozza a mitotikus ciklinek lebomlását és az anafázisba való bejutást [36] . A Sic1 jó példa arra, hogy a rendszerszintű visszacsatolási hurkok hogyan hatnak egymásra a környezeti feltételek érzékelése és a sejtciklus-átmenetek kiváltása érdekében. Bár a tényleges M-G1 átmenet rendkívül összetett, számos fehérjét és szabályozást foglal magában, a dinamikus rendszerszemlélet lehetővé teszi számunkra, hogy egyszerűsítsük ezt a komplex rendszert egy bistabil bemeneti/kimeneti kapcsolattá két nyeregcsomópont-elágazással, amelyben a kimenet (mitotikus kimenet) a kritikus koncentráció. Sic1. Az egyváltozós analízis segítségével meg lehet magyarázni az eukarióta sejtciklus számos irreverzibilis átmeneti pontját, amelyeket a rendszerszintű szabályozás és visszacsatolás szabályoz. Az irreverzibilis átmeneti pontok további példái közé tartozik a Start (egy új sejtosztódási ciklus visszafordíthatatlan elkötelezettsége), ami egy irreverzibilis bistabil kapcsolóval magyarázható, amelynek vezérlési paramétereit szigorúan szabályozzák a rendszer visszacsatolásai, beleértve a Cln2-t, a Whi5 -öt és az SBF - et. 37] .
| sejtciklus | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Fázisok |
| ||||||||||
| Szabályozók |
| ||||||||||