A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC, angol HPLC , High performance liquid chromatography ) az egyik hatékony módszer összetett anyagkeverékek szétválasztására , amelyet széles körben alkalmaznak mind az analitikai kémiában , mind a kémiai technológiában . A kromatográfiás elválasztás alapja az elválasztandó keverék komponenseinek részvétele a van der Waals kölcsönhatások összetett rendszerében (főleg intermolekuláris) a felületen. A HPLC elemzési módszerként egy olyan módszercsoport része, amely a vizsgált objektumok összetettsége miatt magában foglalja a kezdeti komplex keverék előzetes szétválasztását viszonylag egyszerűekre. A kapott egyszerű keverékeket ezután hagyományos fizikai- kémiai módszerekkel vagy speciális kromatográfiás módszerekkel elemzik .
A folyadékkromatográfia elve a keverék komponenseinek elválasztása a két nem elegyedő fázis közötti egyensúlyi eloszlásuk különbsége alapján, amelyek közül az egyik álló, a másik mozgékony ( eluens ).
A HPLC megkülönböztető jellemzője a nagynyomású (400 bar -ig ) és a finomszemcsés szorbensek (általában 3–5 µm , most 1,8 µm) használata. Ez lehetővé teszi az összetett anyagkeverékek gyors és teljes szétválasztását (az átlagos elemzési idő 3-30 perc ).
A HPLC-módszert széles körben használják olyan területeken, mint a kémia , petrolkémia , biológia , biotechnológia , orvostudomány , élelmiszer-feldolgozás , környezetvédelem , gyógyszergyártás és még sok más.
Az elemzett vagy szétválasztott anyagok elválasztási mechanizmusa szerint a HPLC adszorpcióra , eloszlásra , ioncserére , kizárásra , ligandumcserére és másokra oszlik.
Nem szabad megfeledkezni arról, hogy a gyakorlati munkában az elválasztás gyakran nem egy, hanem egyszerre több mechanizmussal történik. Így a kizárásos elválasztást bonyolíthatják az adszorpciós hatások, az adszorpció - eloszlás és fordítva. Ezenkívül minél nagyobb a különbség a mintában lévő anyagok között az ionizáció foka , bázikusság vagy savasság , molekulatömeg , polarizálhatóság és egyéb paraméterek tekintetében, annál valószínűbb, hogy az ilyen anyagok esetében eltérő elválasztási mechanizmus jelenik meg.
Az állófázis polárisabb, mint a mozgófázis, így az eluens összetételében a nem poláris oldószer dominál:
Lásd még: Fordított fázisú kromatográfia
A fordított fázisú HPLC-t ( RP-HPLC fordított fázisból - fordított fázis ) nem poláris állófázis és poláris (vizes) oldószerek felhasználásával hajtják végre . Az állófázis egy hagyományos szilikagél, amelyet RMe2SiCl-dal módosítottak , ahol R jelentése egyenes láncú alkilcsoport, például C18H37 vagy C8H17 . Ennek megfelelően megkülönböztetünk RP-18 és/vagy RP-8 anyagú oszlopokat. Hasonló állófázisok esetén a retenciós idő hosszabb a kevésbé poláris molekulák esetében, míg a poláris molekulák gyorsabban eluálódnak (korábban az analitikai HPLC-ben). A retenciós idő növelhető úgy, hogy több vizet adunk a mozgófázishoz, így a hidrofób analit affinitása a hidrofób állófázishoz erősebbé válik a most már hidrofilebb mozgófázishoz képest. Hasonlóképpen csökkenthető a retenciós idő, ha több szerves oldószert adunk az eluenshez (mozgófázis). A fordított fázisú HPLC-t olyan gyakran használják, hogy gyakran helytelenül egyszerűen HPLC-ként írják le minden további jelölés nélkül. A gyógyszerészetben a fordított fázisú HPLC-t kötelező módszerként használják a gyógyszerek kibocsátás előtti elemzésére.
Az RP-HPLC a hidrofób kölcsönhatások elvén működik, amelyek a vízmolekula dipólusszerkezetének nagy szimmetriája miatt lépnek fel, és az élettudományok összes folyamatában a legfontosabb szerepet tölti be. Az RP-HPLC ezeket a kölcsönhatási erőket méri. Az analit kötődése az álló (stacionárius) fázishoz arányos az analit molekula nem poláris szegmense körüli érintkezési felülettel az állófázis ligandumával. Ezt a szolvofób hatást a víz azon ereje uralja, hogy "csökkenti az üregeket" az analit és a C18 lánc körül, mindkettő komplexéhez képest. Az így felszabaduló energia arányos az eluens felületi feszültségével (víz: 7,3×10–6 J/cm², metanol: 2,2×10–6 J/cm²), illetve az analit, illetve ligandum hidrofób felületével. Az anyag visszatartása az oszlopban csökkenthető, ha a mozgófázishoz kevésbé poláros oldószert (metanol, acetonitril) adunk a víz felületi feszültségének csökkentése érdekében. Az oldószer gradiens ezt a hatást úgy használja ki, hogy az elemzés során automatikusan csökkenti a vizes mozgófázis polaritását és felületi feszültségét.
Az analit molekula szerkezeti tulajdonságai fontos szerepet játszanak az állófázisban való visszatartásának jellemzőiben. Általában egy nagy hidrofób résszel rendelkező analit (C-H, C-C és általában nem poláris atomi kötések, például SS és mások) hosszabb ideig megmarad, mivel nem lép kölcsönhatásba a víz felszínével. Másrészt a szerkezetükben nagy poláris részekkel rendelkező analitok (amelyek szerkezetében poláris csoportok, például -OH, -NH2 , COO- vagy -NH3 + ) kevésbé maradnak meg, mivel jobban kötődnek a vízhez. Az ilyen kölcsönhatások sztérikus hatásoknak lehetnek kitéve: a nagyon nagy molekulák csak korlátozottan férhetnek hozzá az állófázis pórusaihoz, ahol felületi ligandumokkal (alkilláncokkal) való kölcsönhatások lépnek fel. Az ilyen felületi elzáródás általában csökkenti a visszatartást.
A retenciós idő a hidrofób (nem poláris) felület növekedésével növekszik. Az elágazó láncú vegyületek sokkal gyorsabban mosódnak ki, mint a megfelelő lineáris izomerjeik, mivel a teljes felületük csökken. Az egyszeres C-C kötésekkel rendelkező hasonló szerves vegyületek később mosódnak ki, mint a C=C kötéseket vagy hármas C-C kötéseket tartalmazó hasonló vegyületek, mivel a kettős vagy hármas kötések rövidebbek, mint az egyszeres C-C kötések.
A mozgófázis felületi feszültségétől (az eluens szerkezetének szervezőereje) függetlenül a mozgófázis egyéb jellemzői befolyásolhatják az analit retenciós idejét. Például szervetlen sók hozzáadása mérsékelt lineáris növekedést okoz a vizes oldatok felületi feszültségében (kb. 1,5⋅10 -7 J/cm²/mol NaCl esetén, 2,5⋅10-7 J /cm²/mol (NH 4 esetén) ) 2 SO 4 ) és ezért Mivel a vizsgálandó oldat entrópiáját a felületi feszültség szabályozza, a sók hozzáadása a retenciós idő növekedését eredményezi. Hasonló technikát alkalmaznak a fehérjék zökkenőmentes elkülönítésére és kinyerésére, valamint biológiai aktivitásuk védelmére a fehérjeanalízis során (a hidrofób interakciós kromatográfiának, HIC-nek nevezett technika).
Egy másik fontos tényező a mozgófázis pH-ja, amely megváltoztathatja az analit hidrofób jellegét. Ennek érdekében sok módszer puffert, például nátrium-foszfátot használ a pH szabályozására. A pufferoldatok többféle célt szolgálnak: szabályozzák a pH-t, semlegesítik a szilikagél felületén az állófázis töltését, és ionpárosító szerként semlegesítik az analit töltését. Az ammónium-formiátot gyakran használják a tömegspektrometriában, hogy javítsák bizonyos analitok kimutatását azáltal, hogy analit-ammónium adduktumokat képeznek . Illékony szerves savakat, például ecetsavat , vagy gyakrabban hangyasavat adnak a mozgófázishoz, ha tömegspektrometriát használnak az oszlop eluáló komponensének elemzésére. A trifluor-ecetsavat nem gyakran használják a tömegspektrometriában, mivel a detektorban és az oldószerellátó rendszerben marad. Hatékony lehet azonban az analitok, például a karbonsavak visszatartásának javításában . A savak és pufferoldatok hatása a felhasználás típusától függően eltérő, de általában javítják a kromatográfia eredményeit.
Az RP-HPLC oszlopok viszonylag nehezen sérülnek meg a normál szilícium-dioxid oszlopokhoz képest. Azonban sok RP oszlop szilikagél alkilszármazékaiból áll, és szigorúan tilos vizes bázisokkal együtt használni, mivel elpusztítják a szilikagél fő részecskéit. Használhatók vizes savak oldataival, de az oszlopot nem szabad hosszú ideig savaknak kitenni, mert ez korrodálhatja a HPLC készülék fém részeit. Az RP-HPLC oszlopokat használat után tiszta oldószerrel át kell öblíteni a visszamaradt savak és pufferek eltávolítása érdekében, és a „megfelelő oldószerben” tárolni kell (pl. öblítse át metanollal, és hagyja alkoholban a szivattyútömlőket, hogy ne kerüljön levegő az oszlopba). A HPLC-oszlopok fémtartalmát alacsonyan kell tartani, ha fenn akarjuk tartani az anyagok legjobb elválasztási képességét. Az oszlop fémtartalmának jó vizsgálata egy 2,2'- és 4,4'-bipiridin ( bipiridin ) keverékét tartalmazó minta befecskendezése . Mivel a 2,2'-bipiridin fémekkel kelátot képezhet, a 2,2'-bipiridin csúcsa eltorzul ("farokkal"), ha fémionok vannak jelen a szilikagél felületén.
A HPLC-ben használt mátrixok szervetlen vegyületek, például szilícium -dioxid ( szilikagél ) vagy alumínium- oxid , vagy szerves polimerek, például polisztirol (divinil-benzollal térhálósítva) vagy polimetakrilát. A szilikagél természetesen ma már általánosan elfogadott.
A mátrix főbb jellemzői:
Szilikagél előállítása HPLC-hez:
Szorbens részecskék:
A pórusméret a HPLC-ben az egyik legfontosabb paraméter. Minél kisebb a pórusméret, annál rosszabb a permeabilitása az eluált anyagok molekulái számára. Következésképpen minél rosszabb a szorbensek szorpciós kapacitása. Minél nagyobbak a pórusok, annál alacsonyabb egyrészt a szorbens részecskék mechanikai stabilitása, másrészt annál kisebb a szorpciós felület, tehát annál rosszabb a hatásfok.
Normál fázisú HPLC:
Fordított fázisú HPLC:
End-capping - az át nem oltott szorbens helyek védelme "kis" molekulákkal történő további oltással. Hidrofób végzáró (C1, C2): nagyobb szelektivitás, rosszabb nedvesíthetőség; hidrofil végzáró (diol): kisebb szelektivitás, nagyobb nedvesíthetőség.