A 16S rRNS a prokarióta riboszómák gerincét alkotó rRNS három fő típusának egyike . Az rRNS nevében szereplő számok megegyeznek az ülepedési állandó értékével . Ennek megfelelően egy adott molekula esetében ez az érték 16S ( Swedberg-egység ). Összességében háromféle rRNS-t találtak prokarióta mikroorganizmusokban: 23S és 5S a riboszóma nagy alegységében (50S), 16S a riboszóma kis alegységében (30S). Hasonlóképpen, a másik két rRNS-molekula állandója 23, illetve 5 S. A 16S rRNS eukarióta analógja a 18S rRNS [1] .
A mai napig a 16S rRNS-ben és a 18S rRNS-ben található nukleotidszekvenciákat több mint 400 fajnál tanulmányozták a vadon élő állatok különböző birodalmaiból . A 16S rRNS génszekvenciát főként baktériumok és archaea filogenetikai vizsgálatára használják . 2010 óta indul az Earth Microbiome projekt , amely összefogja a témával kapcsolatos kutatásokat. A 16S rRNS génszekvenciát a patogén baktériumok orvosi kutatására is használják.
A 16S rRNS -t először Eisenberg és Litaur izolálta 1959-ben az Escherichia coli RNS fizikai tulajdonságainak izolálására és tanulmányozására irányuló kísérletek során . Az RNS és a DNS -oldatok viszkozitásának összehasonlítása alapján azt sugallták, hogy az RNS egyszálú molekula. A baktériumsejtekből izolált RNS-molekulák elválasztásakor két RNS-frakciót találtak, amelyek különböznek az ülepedési együtthatók értékében. A könnyebb frakció esetében az együttható 16S, a nehezebb frakcióé pedig 25S volt [2] .
Később, az 1960-as években A. Belozersky és A. Spirin azt találta, hogy az rRNS az összes sejt RNS 80-90%-át teszi ki. Először írták le az rRNS szerkezetének és összetételének különbségét prokarióta és eukarióta szervezetekben is. A riboszómák és a prokarióta típusú rRNS felfedezése mitokondriumokban és kloroplasztiszokban a szimbiogenezis elméletének egyik bizonyítéka lett [3] [4] [5] .
A 16S rRNS elsődleges szerkezetét egy 1600 ribonukleotidból álló egyszálú szekvencia képviseli . Az egész szekvenciában, sok faj számára konzervált, és a hipervariábilis régiók egyenletesen oszlanak el. Konzervatívnak nevezzük azokat a régiókat, amelyek szekvenciái kismértékben vagy egyáltalán nem különböznek a vizsgált organizmusokban. A hipervariábilis régiók azok a régiók, amelyek szekvenciái nagymértékben különböznek egymástól távoli élőlényekben, de a közeli rokonságban bizonyos százalékban hasonlóak [6] [7] .
A 16S rRNS gén kilenc hipervariábilis régiót tartalmaz, amelyeket V1-V9-nek nevezünk. Mindegyik régió 30-100 bázispár hosszúságú. Ezek a helyek részt vesznek a riboszóma kis alegysége másodlagos szerkezetének kialakításában . A hipervariábilis régiók között a 16S rRNS gén erősen konzervált szekvenciákat tartalmaz. A hipervariábilis régiók konzervativitási foka nem azonos – kimutatták, hogy a konzerváltabb régiók szekvenciái hasonlóak az élőlényekben a magas rangú taxonok szintjén , és kevésbé konzervatívak – az alacsony taxonómiai besorolású , például nemzetségek szintjén. és fajok [8] [9] .
A 16S rRNS másodlagos szerkezetében 4 jól körülhatárolható domén különíthető el ( a fehérjedoménhez hasonlóan az RNS domén is a molekula stabil, önszerveződő szerkezete): 5'-domén (1-556. aminosavak), centrális. (564-912. aminosavak) és két '-vég (nagy domén 926-1391 és kis domén 1392-1542). A különböző doméneket RNS hajtűkkel végződő hélix választja el egymástól . Ezenkívül a 16S rRNS másodlagos szerkezete 5'- és 3'-páros bázisokat tartalmaz, amelyek hurkokat képeznek. Feltételezzük, hogy ezek a bázisok részt vehetnek a 16S rRNS harmadlagos szerkezetének kialakításában, hidrogénkötéseken keresztül kapcsolódva , nem a kanonikus Watson-Crick báziskötés szerint [11] .
A 16S rRNS-hez a következő funkciókat írták le:
Mindhárom prokarióta rRNS gén (16S, 23S és 5S ) egy ko-transzkripciós operonban található, és tRNS gének és spacer szekvenciák választják el őket . Az elsődleges transzkriptum endonukleázok által végrehajtott feldolgozása során a spacer szekvenciák eltávolításra kerülnek, és termékként megjelennek az intermedierek , végül pedig az érett RNS [13] .
A 16S rRNS a riboszóma kis alegységének alkotóeleme, és fontos szerepet játszik az mRNS dekódolásában . Az rRNS prekurzor a 17S rRNS, amelyet az RNáz III nukleáz bocsát ki az elsődleges transzkriptumból . Az 5'-vég további feldolgozását az E és G RNázok végzik . A 3'-vég feldolgozása jelenleg nem tisztázott [13] .
A 16S rRNS szekvenciát kilenc hipervariábilis régió és az ezeket elválasztó konzervált szekvenciák képviselik. Az elsődleges szerkezet ezen jellemzői miatt javasolták a 16S rRNS gén használatát filogenetikai vizsgálatokhoz . Az első tudós, aki 16S rRNS-t használt a baktériumcsoportok közötti családi kapcsolatok kialakítására, Carl Woese volt . Azt javasolta, hogy a 16S rRNS gén megbízható molekuláris óraként használható , mivel azt találták, hogy az evolúciósan távoli baktériumfajokból származó 16S rRNS szekvenciája és funkciója hasonló [14] [1] [15] .
Így a hipervariábilis régiók lehetővé teszik a különböző fajok egymástól való megkülönböztetését, a nagymértékben konzervált régiók jelenléte pedig lehetővé teszi olyan univerzális primerek létrehozását, amelyek segítségével a baktériumok és az archaeák tanulmányozhatók , függetlenül azok taxonómiai hovatartozásától. Az első pár univerzális primer, amelyet széles körben használnak, Weisburg és munkatársai fejlesztették ki [14] .
Azt is meg kell jegyezni, hogy a kiválasztott primer annealing régió annyira konzervatív, hogy univerzális primerek használhatók a mitokondriumok és kloroplasztiszok 16S rRNS -ének amplifikálására , amelyek az alfa-proteobaktériumok és cianobaktériumok leszármazottai [16] .
Az univerzális primerekkel végzett szekvenálási módszereket az orvosi mikrobiológiában alkalmazzák a bakteriális azonosítás morfológiai módszerének gyors és olcsó alternatívájaként , amely nagyszámú manipulációt igényel, beleértve gyakran a potenciális kórokozó laboratóriumi körülmények közötti hosszú távú tenyésztését. Ezenkívül a szekvenálás megbízhatóbb eredményeket ad [17] . Ebben az iparágban bizonyos hipervariábilis régiókat használnak: például a V3 régió a legjobb a kórokozó nemzetségek azonosítására , a V6 régió a fajok azonosítására [18] .
2010-ben indult az Earth Microbiome projekt , amely ambiciózus feladatként tűzte ki maga elé, hogy globális katalógust hozzon létre a bolygónkon élő, nem tenyésztett mikroorganizmusok biológiai sokféleségéről , vagyis azokról, amelyeket nehéz laboratóriumban termeszteni és fenntartani. . Ez a nagyszabású tanulmány a mikrobiális közösségek elemzését tervezi több mint 200 000 környezeti mintából, amelyeket világszerte laboratóriumok szolgáltattak. A 16S rRNS gének szekvenciáit a mintákban lévő mikroorganizmusok taxonómiai hovatartozásának meghatározására használják. Az összegyűjtött mintákból DNS-t izolálunk, majd PCR -t végzünk 16S rRNS primerekkel. A PCR során kapott amplikonokat szekvenálják . Az ilyen jellegű kutatások során felhasználhatók az Illumina , Ion Torrent szekvenálási technológiák , és más platformok is használhatók . Általános szabály, hogy a hipervariábilis régiók teljes szekvenciáját egyetlen szekvenálási esemény után kaphatjuk meg [19] . A projekt eddig több mint 30 000 mintát elemzett [20] .
Az ilyen vizsgálatok során különös gondot fordítanak a primerek és az amplifikálandó fragmentum kiválasztására . A fő kritérium a vizsgált élőlények (jelen esetben archaeák és baktériumok) teljes lefedettsége és a szekvencia filogenetikai felbontása, vagyis az, hogy a szekvenciából milyen részletességgel lehet meghatározni egy szervezet taxonómiai hovatartozását [21]. .
Az Earth Microbiome Project a V4 és V4-V5 hipervariábilis régiókat használja a mikroorganizmusok osztályozására , mivel ezeket a régiókat tartják optimálisnak a mikrobaközösségek osztályozására . Az ezekhez a fragmensekhez tartozó PCR-láncindítók jobbak a korábban használt 515F, 907R és 806R primerekhez képest. A primerek régi verziójának továbbfejlesztése szükséges volt ahhoz, hogy hosszabb amplikonokat lehessen nyerni, ami lehetővé tette a Crenarachaeota/Thaumarchaeota csoportokból származó élőlények jobb azonosítását, amelyek pontos besorolását korábban nem tudták meghatározni [22] [23]. .
| Felerősítendő terület | Alapozó neve | Primer szekvencia (5'-3') |
|---|---|---|
| V4 | 515F | GTG YCA GCM GCC GCG GTA A |
| V4 [24] | 806R | GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT |
| V4-V5 | 515F | GTG YCA GCM GCC GCG GTA A |
| V4-V5 | 926R | CCG YCA ATT YMT TTR AGT TT |
| V4-V5 [23] | 907R | CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT |
A nagy mennyiségű adat felhalmozásával kiderült, hogy egyes baktériumtípusokat helytelenül osztályozták morfológiai jellemzők szerint. A 16S rRNS szekvenálása alapján új fajokat izoláltak, köztük olyanokat is, amelyeket nem lehetett laboratóriumban tenyészteni [25] [26] , sőt nemzetségeket is [27] . A harmadik generációs szekvenálás megjelenésével számos laboratóriumban lehetővé vált több ezer 16S rRNS szekvencia egyidejű azonosítása néhány órán belül, ami lehetővé teszi metagenomikai vizsgálatok elvégzését , például a bél mikroflóra vizsgálatát [28] .
Az élőlénycsoportok közötti családi kapcsolatok kialakításának leírt módszerének számos előnye mellett (a használat univerzálissága és a végrehajtás relatív sebessége) vannak hátrányai is. Különösen a hipervariábilis régiók nem tesznek különbséget a közeli rokon fajok között . Például a 16S rRNS gén szekvenciái az Enterobacteriaceae , Clostridiaceae és Peptostreptococcaceae családok képviselőiben 99%-ban hasonlóak. Vagyis a V4 hipervariábilis régiója csak néhány nukleotidban térhet el egymástól , ami lehetetlenné teszi az alacsony rangú baktériumok taxonjai közötti megbízható megkülönböztetést. Ha a bakteriális taxonómia tanulmányozása a 16S rRNS hipervariábilis régióinak elemzésére korlátozódik, akkor tévesen összevonhatunk egymással szorosan összefüggő csoportokat egy taxonba, és alábecsülhetjük a vizsgált baktériumcsoport sokféleségét [29] [30] .
Ezenkívül a bakteriális genom több 16S rRNS gént is tartalmazhat, amelyek V1, V2 és V6 hipervariábilis régiói jelentik a legnagyobb intraspecifikus diverzitást. Bár nem a legpontosabb módszer a baktériumfajok osztályozására, a hipervariábilis régiók elemzése továbbra is az egyik leggyakrabban használt módszer a baktériumközösségek vizsgálatára [31] .
Annak a feltételezésnek a fényében, hogy az evolúciót a genetikai anyagnak az ősöktől a leszármazottakig történő vertikális átvitele mozgatja, a 16S rRNS géneket régóta fajspecifikusnak, ezért nagyon pontos markereknek tekintik a prokarióta csoportok közötti kapcsolat meghatározásához . Azonban egyre több megfigyelés utal e gének horizontális átvitelének lehetőségére. A horizontális géntranszfer természetben történő megfigyelései mellett ezekre az eseményekre kísérleti bizonyítékokat is bemutattak. A vizsgálatban egy mutáns Escherichia coli törzset használtak, amelyből hiányzott a saját 16S rRNS génje. Azonban funkcionális riboszóma összeállítását figyelték meg egy nem rokon E. coli baktériumtól kölcsönzött 16S rRNS felhasználásával [32] [15] . Hasonló átjárhatóságot figyeltek meg a Thermus thermophilus esetében is . Ezenkívül teljes és részleges génátvitelt is megfigyeltek a T. thermophilusban . A részleges átvitel egy látszólag véletlenszerű kiméra szekvencia spontán kialakulásában fejeződött ki a gazdabaktérium génje és az idegen gén között [33] .
Tehát a 16S rRNS gén többféle módon fejlődhetett, beleértve a vertikális és horizontális génátvitelt is. Ez utóbbi változat gyakorisága lényegesen magasabb lehet, mint korábban gondolták.
A 16S rRNS gének teljes szekvenciáját, mint sok mást is, leolvasásokból állítják össze – bizonyos szekvenálás után kapott nukleotidszekvenciákból . A szekvenálás az Illumina platformon történik (az olvasási hossz eléri a 250 bázispárt); Sanger szekvenálási technológiával (leolvasások hossza - 1000 bázispárig); ion-félvezető szekvenálás segítségével (leolvasások hossza - 200 bázispárig). Ezután a leolvasott értékeket összehasonlítjuk a 16S rRNS gén referenciaszekvenciájával, így a teljes génszekvencia sok leolvasásból áll össze.
A 16S rRNS génszekvenciákat baktériumok és archaea típusú törzsekre határozták meg, és nyílt adatbázisokban, például NCBI -ban gyűjtötték össze . Az ilyen adatbázisokban található szekvenált szekvenciák minőségét azonban gyakran nem ellenőrzik. Ennek eredményeként a csak 16S rRNS génszekvenciákat tartalmazó másodlagos adatbázisokat széles körben használják [34] . Az alábbiakban felsoroljuk a leggyakrabban használt adatbázisokat.
Az EzBioCloud adatbázis, korábban EzTaxon néven, egy teljes hierarchikus taxonómiai rendszerből áll, amely 2020 februárjában 65 342 bakteriális és régebbi 16S rRNS szekvenciát tartalmaz. Az EzBioCloud adatbázist szisztematikusan gondozzák és rendszeresen frissítik. Ezenkívül az adatbázis weboldal bioinformatikai eszközöket is kínál , például az ANI-kalkulátort, amellyel százalékos hasonlóságot találhat a prokarióta genomok két szekvenciája között, egy páronkénti illesztési eszközt két szekvenciához, és sok más eszközt [35] .
Az RDP egy kurált adatbázis, amely rRNS-szekvencia információkat, valamint kapcsolódó programokat és szolgáltatásokat nyújt. A javasolt tartalom filogenetikai csoportosított rRNS - illesztéseket, igazításból származó filogenetikai fákat , rRNS másodlagos struktúrákat és különféle programokat tartalmaz az rRNS-génkutatáshoz szükséges információk megjelenítésére és elemzésére. A legtöbb szoftvercsomag letölthető és helyi használatra elérhető [36] .
A SILVA egy olyan adatbázis, amely manuálisan ellenőrzött és rendszeresen frissített riboszóma kis alegység (16S/18S) és nagy riboszóma alegység (23S/28S) rRNS szekvencia-sorrendjét tartalmazza mindhárom életdoménre vonatkozóan . Az adatbázis alapján egy szolgáltatást is készítettek primer tervezésére és filogenetikai illesztések készítésére [37] .