A fluoreszcencia mikroszkópia egy olyan módszer , amellyel a minta gerjesztett atomjainak és molekuláinak lumineszcenciáját használjuk felnagyított képhez . Széles körben használják az anyagtudományban és az orvosbiológiai területeken.
A molekulák képesek fénykvantumokat elnyelni és elektronikusan gerjesztett állapotokba menni. A molekula „normál” (alap) állapotába való visszatérését fénykibocsátással kísérve fluoreszcenciának nevezzük . Az abszorpciót és a fluoreszcenciát a molekula elektronjainak energiaszintjének szerkezete határozza meg, ezért minden egyes molekulatípus sajátos tulajdonsága (a részleteket lásd az elektronrezgés spektroszkópia című cikkben ).
A biológiai anyag általában nagyon gyengén fluoreszkál önmagában, de a fényes és változatos fluoreszcens molekulák ( fluoroforok ) alkalmazása miatt, amelyek specifikusan képesek megfesteni a szövetek és sejtek különböző szerkezeteit, a fluoreszcens mikroszkópos módszer nagyon értékesnek bizonyult orvosbiológiai tudományok.
A fluoreszcens mikroszkópos hagyományos módszerek lényegesen kisebb felbontásúak az elektron- vagy atomerőmikroszkópiához képest . Utóbbitól eltérően azonban az optikai mikroszkópia lehetővé teszi a sejtek és akár a kisméretű szervezetek belső mikroszerkezetének megfigyelését is, nemcsak rögzített, hanem élő is. Ennek köszönhetően a fluoreszcens mikroszkópia bizonyult a legjobb módszernek az élőlények működési mechanizmusainak sejt-, szubcelluláris és molekuláris szintű vizsgálatára.
Fluoreszcens mikroszkópban a mintát magasabb frekvenciájú fénnyel sugározzák be , és a képet az optikai spektrumban kapják meg. A minta sugárzását egy szűrőn vezetik át, amely a gerjesztési frekvencián levágja a fényt. A fluoreszcens készítmény képe speciális digitális fényképezőgéppel fényképezhető, amely lehetővé teszi a hosszú expozíciós fényképek készítését. Egyes képeknél ez az idő akár 60 perc is lehet.
A fluoreszcens mikroszkópia intenzív fejlődése a 20. és 21. század fordulóján új módszerek – a kétfoton és konfokális mikroszkópia – kifejlesztéséhez vezetett , valamint számos olyan megközelítéshez, amelyek lehetővé tették az optikai felbontás diffrakciós gátjának leküzdését, ill. soha nem látott nanofelbontást érhet el.
A fluoreszcens mikroszkópia egyik típusa a konfokális mikroszkóp , egy olyan módszer, amellyel a minta adott rétegéről képet kaphatunk, megszabadulva a feletti és alatti rétegek hozzájárulásától. Így ennek a módszernek a felbontása összehasonlítható a három koordinátatengely mentén. A fluoreszcens mikroszkóp egy másik típusa, az epifluoreszcens mikroszkópia lehetővé teszi a minta felületének és szűk felületközeli zónájának vizsgálatát.
A teljes belső reflexiós fluoreszcencia mikroszkóp (TIRFM) az elektromágneses hullámok két átlátszó közeg közötti interfészről való visszaverődésének jelenségén alapul , amely akkor következik be, amikor egy hullám a kritikus szögnél nagyobb szögben beesik egy magasabb törésmutatójú közegből (1 /n). A második közegbe behatoló sugárzás intenzitása egy exponenciális törvény szerint csökken, ami lehetővé teszi az ezzel a sugárzással gerjesztett fluoreszcens tárgyak detektálását ~100 nm vastag határrétegben 10 nm -es felbontásig [1] . Így a TIRFM joggal tekinthető a fluoreszcens nanoszkópia egyik módszerének. A biológiában a módszert a sejtek plazmamembránjának és membránszerkezetének megjelenítésére használják.
Az elmúlt években számos új megközelítést fejlesztettek ki a fluoreszcens mikroszkópia területén, amelyek lehetővé tették az optikai felbontás diffrakciós gátjának leküzdését és nagyon magas ~10 nm elérését. Ezeket a módszereket kezdték egyesíteni a fluoreszcens nanoszkópia általános elnevezéssel.