Kétfoton lézermikroszkóp - lézermikroszkóp , amely lehetővé teszi élő szövetek megfigyelését egy milliméternél nagyobb mélységben, a fluoreszcencia jelensége segítségével . A kétfotonos mikroszkóp a többfoton fluoreszcens mikroszkóp egy fajtája . Előnye a konfokális mikroszkóppal szemben a nagy áthatoló ereje és az alacsony fototoxicitás [1] .
A kétfotonos mikroszkópot először Winfred Denk konstruálta meg W. W. Webb laboratóriumában a Cornell Egyetemen [2] . A kétfotonos gerjesztés ötletét lézeres szkenneléssel kombinálta.
A kétfotonos lézermikroszkóp azon a fizikai elven alapul, amelyet Maria Goeppert-Mayer 1931-ben írt le doktori disszertációjában [3] .
A kétfotonos gerjesztés folyamata a következőképpen megy végbe: két kis energiájú foton gerjeszt egy fluorofort (fluoreszcenciára képes molekulát vagy molekularészt) egy kvantumesemény során. Ennek a gerjesztésnek az eredménye egy fluoreszcens foton emissziója a gerjesztett molekulák által. A fluoreszcens foton energiája nagyobb, mint az izgató fotonok energiája.
Nagyon kicsi annak a valószínűsége, hogy egy molekula mindkét gerjesztési fotont elnyeli. Ezért izgalmas fotonok nagy fluxusára van szükség, amelyet nagy impulzusismétlési sebességű (80 MHz) fotonokat kibocsátó lézerrel lehet elérni. A leggyakrabban használt fluoroforok gerjesztési spektruma 400-500 nm, míg a gerjesztő lézer hullámhossza 700-1000 nm (infravörös tartomány). Ha a fluorofor egyszerre két fotont nyel el, akkor elegendő energiát kap ahhoz, hogy gerjesztett állapotba kerüljön. Ezután a gerjesztett fluorofor egy fotont bocsát ki (a spektrum látható részében), amelynek hullámhossza a fluorofor típusától függ.
Mivel két foton abszorpciója szükséges ahhoz, hogy a fluorofor gerjesztett állapotba kerüljön, annak valószínűsége, hogy a fluorofor egy másodlagos fotont bocsát ki, arányos a gerjesztési intenzitás négyzetével. Ezért a fluoreszcencia erősebb lesz, ha a lézersugár egyértelműen fókuszált és nem szóródik. A maximális fluoreszcencia a fókusztérfogatban figyelhető meg (az a térfogat, ahol a lézersugár fókuszálódik), és az éles csökkenést mutatja a fókuszon kívüli régióban.
Egy kétfotonos mikroszkópban az infravörös lézersugarat egy konvergáló objektívlencse segítségével fókuszálják . Általában nagyfrekvenciás, 80 MHz-es zafírlézert használnak, amely 100 femtoszekundumos impulzust bocsát ki, amely biztosítja a kétfotonos abszorpcióhoz szükséges nagy fotonfluxussűrűséget.
A fluoreszkáló mintákból kibocsátott fényt egy nagyon érzékeny fotosokszorozó cső segítségével erősítik fel . Mivel a fényvevő egycsatornás, az adott fókusztérfogatban megfigyelt fényintenzitás egy képpixelt alkot . A kétdimenziós pixelkép készítése érdekében a minta fókuszsíkjában szkennelést végeznek.
Az infravörös fény alkalmazása a fluorofor gerjesztésére a vizsgált szövetekben megvannak a maga előnyei [4] :
De van néhány hátránya is: