Üveg mikroelektróda

Az üveg mikroelektróda egy elektrolittal töltött  nagyon vékony üveg pipetta . Az elektrofiziológiában használják . A mikroelektródos módszerek fejlődése lehetővé tette az elektrofiziológiai vizsgálatok elvégzését az egyes sejtek szintjén.

Az üveg mikroelektróda hegyének átmérője körülbelül 0,5 µm, néha kevesebb, mint 0,1 µm [1] , optikai mikroszkóppal nézve előfordulhat, hogy nem lehet megkülönböztetni.

Ezt a műszert nem szabad összetéveszteni az ionometrikus üvegelektródák karcsú modelljeivel , különösen az elektrofiziológiában is használt modellekkel.

Alkalmazás

A mikroelektródák használatának három fő módja van:

• a sejtmembránok elektromos paramétereinek intracelluláris regisztrálására ,
• sejtmembránok elektromos áram általi polarizálására,
• különböző anyagok sejtbe juttatására ( iontoforézis ) vagy azok felszínére való ellátására (alkalmazás).

A mikroelektróda technológia továbbfejlesztése a potenciál lokális rögzítésének módszere ( patch clamp módszer ) [2] . Az ehhez a módszerhez kifejlesztett speciális mikroelektródákat általában mikropipettáknak nevezik . A módszer érzékenysége lehetővé teszi a sejtmembrán egyes ioncsatornáinak aktivitásának regisztrálását.

Történelem

Az üveg mikroelektródák élettani fejlesztése előtt fémelektródákat használtak, például elektrokémiailag köszörült volfrámhuzalból [3] . A fémelektródák alacsony elektromos ellenállása lehetővé tette az alacsony bemeneti ellenállású primitív rögzítőberendezések használatát. Egyes területeken még ma is használnak ilyen elektródákat.

Az üveg mikroelektródákat először 1949-ben [4] G. Ling és R. V. Gerard használta a béka myocyták membránpotenciáljának rögzítésére irányuló munkájuk során .

V. L. Nastuk és A. L. Khodzhkin 1950-ben [5] mikroelektróda technikával regisztrálták egy izomrost akciós potenciálját .

Az üveg mikroelektródák használatát anyagoknak a sejtmembránra történő felvitelére VL Nastuk javasolta 1953-ban [6] .

A Szovjetunióban a mikroelektróda technikát Platon Grigorjevics Kosztjuk [7] ültette át a gyakorlatba . A Moszkvai Állami Egyetem Biológiai Karán G. A. Kurella munkája során a mikroelektróda technikát és a miniatűr üvegionometrikus elektródákat egyaránt használta a szubcelluláris struktúrák tanulmányozására.[ pontosítás ] [8] .

Tervezés és gyártás

A mikroelektródák gyártásának anyaga körülbelül 1 mm átmérőjű üvegkapilláris. Általában a " Pyrex " márkájú üveget használják, ritkábban más típusú üveget - alumínium-szilikát 38-ЗС és kvarcüveget. Gyakran egy üvegszálas kapillárist használnak üresnek - ebben az esetben a mikroelektród elektrolittal való feltöltése a jövőben megkönnyíthető. A nyersdarabokat alaposan megtisztítják.

A mikropipetta előkészítése

Üveg mikroelektródát úgy készítenek, hogy egy fűtött kapillárist nyújtanak és törnek egy speciális eszközön - egy húzón (mikrokovács). A kapott mikroelektróda paraméterei a kiválasztott üvegtípustól, a kapilláris átmérőtől, a fűtési hőmérséklettől, a rángatás kezdetének pillanatától és erősségétől függenek. [1] A modern mikroprocesszoros vezérlésű lehúzók legfejlettebb modelljei lehetővé teszik a visszahúzható mikropipetta hegyének különböző formáinak programozását [9] , előre meghatározott tulajdonságokat és jó ismételhetőséget biztosítva.

A kapott munkadarab hengeres része fokozatosan beszűkül, és átszúró részgé válik. A megnyúlt mikropipettákat mikroszkóp alatt vizsgáljuk, 0,5 μm-nél kisebb átmérőjű átszúrócsúcs esetén nem lehet megkülönböztetni, elveszik az interferencia peremén. Egyes esetekben a mikroelektróda hegye speciális módon meg van élezve vagy megolvasztva.

A patch bilincsekhez való mikroelektródák ezenkívül szilikonnal vannak bevonva, hogy biztosítsák a gigaohm érintkezést a sejtmembrán megérintésekor.

Az elektróda feltöltése

A munkadarabot elektrolittal töltik fel, leggyakrabban 2-3 M kálium-klorid oldattal. Néha eltérő összetételű elektrolitokat használnak, vagy az elektródát alacsony olvadáspontú fémmel töltik meg, például Wood-ötvözet [10] .

Az elektródák feltöltése a munkarész nagyon kis átmérője miatt nehézkes lehet. Ennek megkönnyítésére számos technikát javasoltak: vákuumba töltést, alkohollal való előtöltést, majd az alkoholt elektrolittal helyettesítik [11] . Jelenleg széles körben elterjedt a Tasaki által javasolt módszer [12] , amelyben mikropipettába olvasztott üvegszálat használnak, miközben a mikroelektródát kapilláris erők hatására töltik meg [13] .

Csatlakozás és vezérlés

Az elektródák mérőberendezéshez történő csatlakoztatásához elektrolittal töltött befogópatronba kell rögzíteni, vagy a megtöltött elektróda hengeres részébe klórozott ezüsthuzalt kell behelyezni .

A feltöltött és csatlakoztatott mikroelektróda minőségét az ellenállásának mérésével ellenőrzik, amely megaohm nagyságrendű. Az alacsonyabb ellenállás azt jelzi, hogy a mikroelektróda hegye letört, a nagyobb vagy kaotikusan változó ellenállás azt jelzi, hogy a szúrócsúcs eltömődött szennyeződéssel.

A kész mikroelektródákat rosszul tárolják, ezért általában közvetlenül a kísérlet megkezdése előtt készülnek [14] . Egy ideig, legfeljebb egy napig, hűtőszekrényben tárolhatók, elektrolitos pohárba merítve. A hosszú távú tárolás során az elektródák az elektrolit kikristályosodása miatt elveszítik hasznosságukat, előfordulhat, hogy mikroorganizmus-telepekkel szaporodnak [15] .

A mikroelektródák fizikai és kémiai tulajdonságai

Különféle fizikai-kémiai folyamatok játszódnak le a mikroelektród és a közeg között, amelybe belemerül (fiziológiás oldat, sejttartalom).

• Diffúzió . A mikroelektródában az elektrolit koncentrációja magasabb, mint a környezetében, így az elektrolit anyagok diffúzió következtében a fiziológiás oldatba vagy a sejtbe jutnak [16] [Pl. 1] .

• Iontoforézis
• Elektroozmózis
• Hidrosztatikus folyamatok

Mikroelektródák elektromos tulajdonságai

Az elektromos ellenállás  a mikroelektródák legfontosabb paramétere. Az ellenállást a kísérlet megkezdése előtt, esetenként a munkavégzés közben is ellenőrizni kell. Érvényes elektróda esetén az ellenállás 5 és 20 MΩ között van. Az 1 MΩ-nál kisebb ellenállás az átszúrt rész törésének jele, több mint 60 MΩ - az elektróda hegye túl vékony, vagy eltömődött a vizsgált tárgy kicsapódott kristályaitól vagy részecskéitől [17] . A véletlenszerűen változó ellenállás a szennyezett elektródákra is jellemző [14] . A nagy ellenállású elektródák nagy belső zajjal és elektromágneses interferenciával szembeni érzékenységgel rendelkeznek. 1 nA-t meghaladó áramoknál a mikroelektródák áram-feszültség karakterisztikája nemlineárissá válhat. Az elektródák ellenállásának kiszámítása lehetséges, de bonyolult és nem biztosít nagy pontosságot, ezért a gyakorlatban az elektróda ellenállását kísérleti úton határozzák meg [18] .

elektróda kapacitása . A saját kapacitású mikroelektróda jelenléte torzítja a rögzített jel alakját. Ezért igyekeznek csökkenteni és kompenzálni: növelni az elektróda hengeres részének átmérőjét, csökkenteni a hosszát, igyekezni a lehető legrövidebb vezetékeket használni az erősítőhöz való csatlakozáshoz. Az erősítő bemeneti fokozatában lévő elektróda kapacitásának kompenzálására kapacitív negatív visszacsatolást alkalmaznak . A kapacitáskompenzáció vezérlése téglalap alakú jellel történik az elektródára  - megfelelő beállítás mellett az előlap alakja nem torzul [19] .

Eltolási potenciál . Több okból is előfordul. A főbbek a következők:

• diffúziós potenciál - az elektródát kitöltő elektrolit és az oldat között keletkezik, amelybe belemerül. A diffúziós potenciál csökkentésére kálium-klorid oldatot használnak elektrolitként, mivel a K+ és a Cl- ionok töltése azonos, diffúziós együtthatója pedig közel van.
• potenciál a mikroelektróda és a referenciaelektróda ezüstvezetői között
• vágási potenciál. Előfordulása az elektrolit és az üveg közötti érintkezés tulajdonságaival függ össze a mikropipetta keskeny hegyében [20] .

Az erősítőhöz csatlakoztatott és sóoldatba merített elektróda előfeszítési potenciálját az erősítő beállításával kompenzáljuk.

A nem kívánt önpotenciál csökkentésére a következő módszereket is alkalmazzák [21] :

• üveglapok alapos tisztítása lúgban és alkoholban történő mosással;
• frissen készített mikropipetták használata;
• nagy koncentrációjú elektrolitok töltésére használható;
• elektrolit savanyítás;
• alacsony ohmos ellenállású elektródák kiválasztása;
• alacsony önpotenciálú elektródák kiválasztása.

A mikroelektródák típusai

Többcsatornás mikroelektródák

A többcsatornás mikroelektródákat gyakran alkalmazzák az iontoforézist (mikroelektroforézist) alkalmazó vizsgálatok során. Lehetővé teszik az elektromos aktivitás egyidejű regisztrálását és a hatóanyagok bejuttatását a szomszédos mikropipetta tengelyekből. Az ilyen összetett elektródák csatornáinak száma általában legalább három: az egyik a regisztrálásra, a második az áramhatások kompenzálására és szabályozására, a harmadik pedig a vizsgált anyag bevezetésére szolgál [22] .

Az egyes csatornák egymással párhuzamosan vagy koaxiálisan is elhelyezhetők.

A többcsatornás mikroelektródák nagy parazitakapacitását néha úgy kompenzálják, hogy vezetőképes ernyőt hoznak létre fém vagy grafit porlasztásával a nem működő részen [22] .

A centrifugálással többcsatornás mikroelektródákat tölthetünk elektrolittal és a vizsgált anyagok oldataival .

A többcsatornás mikroelektródák előállítása technikailag nehéz; azt állították, hogy gyártásuk éppúgy művészet, mint tudomány [23] .

Kompozit mikroelektródák

Ugyanarra a célra használják, mint a többcsatornásakat. A kompozit mikroelektródák erősebben sértik a sejtet, azonban elektromos jellemzőik gyakran felülmúlják a többcsatornásakat. Külön mikroelektródákról gyűjtik össze, mikroszkóp alatt irányítják a munkát [22] .

Lebegő mikroelektród

Woodbury és Brady [24] által javasolt lebegő mikroelektródákat használnak a sejtek elektromos aktivitásának rögzítésére összehúzódó szövetekben, például a szívizomban . Könnyű kialakításúak, nagyon rövid hengeres résszel, vékony ezüst- vagy volfrámhuzalra vannak rögzítve egy csepp lakkal. Mikromanipulátorral az elektródát a szövet felszínére visszük, és leengedjük rá. Saját súlyának hatására fecskendezik be a szövetbe; amikor az elektróda belép a cellába, feszültségugrás figyelhető meg.

A huzal rugalmassága miatt az elektróda együtt mozoghat a szövettel, amelybe behelyezték. A gyakorlatban lehetőség van az elektródát néhány percig a cellában tartani. .

Mikropipetták patch bilincsekhez

Erősítők üveg mikroelektródákkal való munkához

Az üveg mikroelektródákkal használt biopotenciálerősítőknek a következő jellemzőkkel kell rendelkezniük [25] :

• a bemeneti áramkör kapacitásának kompenzációs áramkörének megléte;
• bemeneti feszültség tartomány ± 1V;
• eltolás beállítása ± 300 mV;
• a szivárgási áramok kisebbek, mint 14 pA;
• jel felfutási ideje - legfeljebb 100 ms;
• hőmérséklet-drift  - kevesebb, mint 50 μV.

A patch clamp módszerrel való munkához speciális erősítőket használnak.

Lásd még

• Biopotenciálok erősítője
• akciós potenciál

Jegyzetek

1. ↑ 1 2 Kamkin, 2011 , p. 26.
2. ↑ Hamill OP, Marty F., Neher E. et al. Továbbfejlesztett patch-clamp technikák nagy felbontású áramfelvételhez sejt- és cekk-mentes membránfoltokról // Europ. J Physiok. - 1981. - 1. évf. 391. (2) 85-100.
3. ↑ Kozsechkin, 1975 , p. 63.
4. ↑ 1949, G. Ling & RW Gerard, A béka sartorius rostok normál membránpotenciálja, in: J. Cell. Összeg. Physiol., 34, p. 383-96.
5. ↑ Nastuk WL, Hodgkin AL (1950). "Egyetlen izomrostok elektromos aktivitása". J. Cell. Összeg. fiziol. 35:39-73
6. ↑ Nastuk WL Az izomsejtek membránjának elektromos aktivitása a neuromuszkuláris jumctionnál - J. Cellular Comp. fiziol. — v. 42, 249-272, 1953
7. ↑ Kosztjuk Platon Grigorjevics // Nagy Szovjet Enciklopédia  : [30 kötetben]  / ch. szerk. A. M. Prohorov . - 3. kiadás - M .  : Szovjet Enciklopédia, 1969-1978.
8. ↑ G. A. Kurella és Litvin F. F. - Kondrashin A. A., Samuilov V. D. Sun - energia - élet tanulmányairól. // Az evolúció elmélete úgy, ahogy van archiválva 2011. július 19-én a Wayback Machine -nél .
9. ↑ [1] Archiválva : 2018. február 13. a Wayback Machine Warner Instruments-nél A PMP-102 egy mikroprocesszor által vezérelt lehúzó.
10. ↑ Shanes AM  – A fiziológiai és farmakológiai hatás elektrokémiai vonatkozásai ingerlékeny sejtekben – Pharmacol. Revs., v.10, p.59-164, 1958
11. ↑ Goffman B., Cranefield P. A szív elektrofiziológiája. — Fordítás angolból. Tsuzmer E. S. szerk. Babsky E. B. - M .: Külföldi Irodalmi Kiadó - 1962
12. ↑ Tasaki I., Tsukahara Y., Ito S., Wayner MJ, Yu WY Egyszerű, közvetlen és gyors módszer mikroelektródák töltésére. — Physiol. Behav., 1968, 3. v., p. 1009-1010.
13. ↑ Kamkin, 2007 .
14. ↑ 1 2 Nagy műhely az élettanról: tankönyv. juttatás diákoknak. magasabb tankönyv intézmények / A. G. Kamkin és mások M.: Izd. "Akadémia" Központ 2007.
15. ↑ Kozsechkin, 1975 , p. 82.
16. ↑ Kamkin, 1989 , p. 108.
17. ↑ Kamkin, 2011 , p. 32.
18. ↑ Kamkin, 1989 , p. 112.
19. ↑ Kamkin, 2011 , p. 33.
20. ↑ Kamkin, 2011 , p. 34.
21. ↑ Kozsechkin, 1975 , p. 76.
22. ↑ 1 2 3 Alexandrov A. A. Mikroelektroforézis módszere a fiziológiában. - L .: Nauka, 1983. - 148 p. — (Az élettani kutatás módszerei).
23. ↑ Kelly JS Gyógyszerek mikroiontoforetikus alkalmazása egyetlen neuronra. - In: A pszichofarvakológia kézikönyve. New York; London, 1975, 2. v., p. 29-67
24. ↑ Woodbury JW, Brady AJ Intracelluláris felvétel a Moving Tissues-ből rugalmasan szerelt mikroelektródával – Science, 123, p. 100-101, 1956
25. ↑ Kamkin, 2011 , p. 43.

Jegyzetek

1. ↑ Némi egyszerűsítéssel a diffúziós sebesség (mol/s) a következőképpen becsülhető: , ahol  az elektrolit koncentráció,  a diffúziós együttható,  az elektródacsúcs belső szögének fele, állandó az ilyen típusú elektródákra,  a a piercingvég belső sugara. Vagyis a diffúziós sebesség egyenesen arányos a szúrócsúcs vastagságával és a mikroelektródát kitöltő elektrolit koncentrációjával.

Irodalom

• Kamkin A. G., Kiseleva I. S. Technikai támogatás a sejtek mikroelektródos vizsgálatához / szerk. I. S. Kiseleva. - M . : 2 MGOLMI őket. N. I. Pirogova, 1989. - 174 p. - 1000 példányban. másolat.
• Kamkin A. G. et al. Nagy műhely a fiziológiáról: tankönyv. juttatás diákoknak. magasabb tankönyv létesítmények. - M . : Szerk. "Akadémia" központ, 2007. - ISBN 978-5-7695-2723-4 .
• Élettan: útmutató a kísérleti munkához: tankönyv. pótlék / szerk. Kamkina G. A., Kiseleva I. S. - M. : GEOTAR-Media, 2011. - 384 p. - ISBN 978-5-9704-1777-5 .
• Kozhechkin S. N. Mikroelektródák // Eszközök és módszerek a sejtek mikroelektródos vizsgálatához / szerk. Veprintsev B. N., Krasts I. V. - Pushchino: A Szovjetunió Tudományos Akadémia Biológiai Kutatási Tudományos Központja Pushchinóban, 1975. - 800 példány.
• Kostyuk P. G. Mikroelektróda technika. - Kijev: "Naukova Dumka", 1960.
• Purvis R. Az intracelluláris regisztráció és iontoforézis mikroelektródos módszerei: Per. angolból = Microelectrode methods for intracelluláris felvétel és ionoforézis - RD Purves. - M . : "Mir", 1983. - 208 p. - 2300 példány.