DNS hibridizáció

DNS hibridizáció , nukleinsav hibridizáció - komplementer egyszálú nukleinsavak in vitro kombinációja egy molekulává. Teljes komplementaritás esetén a kombináció egyszerű és gyors, részleges komplementaritás hiánya esetén a láncok összeolvadása lelassul, ami lehetővé teszi a komplementaritás mértékének felmérését. DNS-DNS és DNS-RNS hibridizáció lehetséges.

Kísérleti napló

A kétszálú DNS -t megfelelő pufferben felmelegítjük . A külső körülmények változása miatt a komplementer nitrogénbázisok közötti hidrogénkötések termodinamikailag kedvezőtlenné válnak, és a láncok szétválnak.
A denaturált DNS-készítményt összekeverik más denaturált DNS-sel.
A preparátumokat lassan lehűtik, miközben az egyszálú DNS hibridizálódik egymással (a komplementer bázisok között hidrogénkötések jönnek létre), miközben "hibrid" DNS-molekula jön létre.

Az egyszálú DNS összekapcsolódási (=hibridizációs) sebességének elemzése lehetővé teszi a DNS-szekvenciák hasonlóságának és különbségének értékelését az azonos fajhoz tartozó fajok vagy egyedek között.

A DNS olvadáspontjának kiszámítása

A DNS másodlagos szerkezete fontos szerepet játszik a biológiában, a genetikai diagnosztikában és a molekuláris biológia és nanotechnológia egyéb módszereiben. Ezért a DNS- vagy RNS -molekulák olvadási hőmérsékletének pontos meghatározása nagyon fontos szerepet játszik minden molekuláris biológiai módszerben, például a minták vagy oligonukleotidok kiválasztásában a microarray-ekhez vagy a primerek kiválasztásához a PCR -hez . Számos egyszerű képlet létezik a rövid oligonukleotidok olvadáspontjának kiszámítására. Egy rövid oligonukleotid (<20 nukleotid ) olvadási hőmérsékletének (T m ) durva kiszámítását a nukleotidok számának közvetlen megszámlálásával végezzük (G + C az összes guanin és citozin összege , L a nukleotid hossza oligonukleotid):

$T_{m}=2(L+G+C)$ , [1]

Átlagos képlet a Tm kiszámításához egy rövid oligonukleotidra (és hosszú DNS-fragmensekre), figyelembe véve a K + -ionok és a DMSO koncentrációját :

$T_{m}=77,1+11,7\lg[K^{+}]+{\frac {41(G+C)-528}{L))-0,75[\%DMSO]$ , [2]

Ezek az egyenletek azonban nem veszik figyelembe az oligonukleotid-hibridizáció során bekövetkező kötődési iniciációt, nem veszik figyelembe magának a szekvenciának a jellemzőit és az oligonukleotid-duplexekre jellemző véghatást. Ezért ez a képlet alkalmasabb, ha a DNS-szekvenciát átlagoljuk, és a duplexek hossza meghaladja a 40 nukleotidot.

A DNS termodinamikája

A kétszálú vagy egyszálú DNS olvadáspontjának számítására manapság a legelterjedtebb módszer egy kétlépcsős termodinamikai modellen alapul. Két komplementer DNS-molekula A és B vagy kötődik egymáshoz, vagy szabad az oldatban („random coil state”). Általában azt feltételezik, hogy az A és B molekulák teljesen komplementerek, így hibridizációjuk nyilvánvaló, és a duplexben egy vagy több komplementaritási hiba megengedett, beleértve a nem komplementer GG, GT és GA párokat ( wobble pairs ). Egyetlen molekula esetén azt feltételezzük, hogy hurokszerkezetbe van csomagolva. A duplex hibridizáció folyamatát a következő képlet írja le:

$A+B\longleftrightarrow AB$

ahol A és B különböző láncok az oldatban („random coil state”), és AB a kialakult duplex. Ez a reakció visszafordítható. kEnnek a reakciónak az egyensúlyi állandóját a következőképpen határozzuk meg: . $k={\frac {[AB]}{[A][B]}}$

Az egyensúlyi állandó a lánckoncentrációtól, a hőmérséklettől, a sókoncentrációtól, a pH-tól és a reakció egyéb összetevőitől (pl . glicerintől vagy DMSO -tól ) függ. A konstans k változik az egyik vagy mindkét lánc ([At] és/vagy [Bt]) koncentrációjának változására, majd a teljes rendszer reagál a változásokra, majd az [A], [B] egyes koncentrációi. és az [AB] is megváltozik. Például, ha több A lánc van a rendszerben, akkor az [AB] koncentrációja nő. Tegyük fel, hogy az egyensúlyi állandó 1,81×10 6 , és a láncok koncentrációja [At] = [Bt] = 10 −5 M:

$k=1,81\cdot 10^{6}={\frac {[AB]}{[A][B]}}$

$[At]=10^{-5}M=[A]+[AB]$

$[Bt]=10^{-5}M=[B]+[AB]$

A számítási képletekben a komponenseket helyettesítjük k:

$k={\frac {[AB]}{([A]-[AB])([Bt]-[AB]))))$

$k=1,81\cdot 10^{6}={\frac {[AB]}{[A][B]}}$

$1.81\cdot 10^{6}={\frac {[AB]}{(10^{-5}-[AB])(10^{-5}-[AB])))$

Átrendezés után a következőket kapjuk:

$O=k[AB]^{2}-{\frac {k[At]+k[Bt]+1}{[AB]+k[At][Bt]}}$

$O=aX^{2}+bX+c$

ahol . $[AB]=X={\frac {\pm b{\sqrt {(}}b^{2}-4ac)}{2a}}$

Például, ha ebbe a képletbe behelyettesítjük az [AB] = 7,91 × 10 -6 M értéket, a láncok koncentrációja [A] = [B] = 2,09 × 10 -6 M. Vagyis a láncoknak csak 79%-a [At ] a duplex egységben lesz csatlakoztatva [AB ].

Meg lehet-e határozni az egyensúlyi állandókat a hőmérséklet változásával? Ez elvezet bennünket az olyan fontos termodinamikai paraméterek megértéséhez, mint a szabadenergia (dG), az entalpia (dH) és az entrópia (dS). A szabadenergia, az entalpia és az entrópia változásai a "T hibridizációs hőmérsékletről" a rendezetlen, véletlenszerű állapotba való átmenet során következnek be. Ezeket az összefüggéseket a képlet határozza meg dG = dH – TdS(lánckoncentráció esetén [A] = [B] = [AB] = 1M), akkor az ideális képlet a Gibbs-szabadenergia kiszámításához:

$dG_{T}^{0}={\frac {dH^{0}-TdS^{0}}{1000}}$

ahol Ta hőmérséklet Kelvinben van megadva, dH° (cal/mol) és dS° (cal/mol K).

Van egy hasznos összefüggés, amely a Gibbs-szabadenergia változását a kémiai reakció során az egyensúlyi állandóhoz köti:

$dG_{T}^{0}=-RT\cdot \ln(k)$

ahol R az univerzális gázállandó (1,987 cal/mol K).

A két képletet kombinálva a következőket kapjuk:

$T={\frac {dH^{0}}{dS^{0}-R\ln(k)))$

Az olvadási hőmérsékletet (T m ) egyensúlyban határozzuk meg, amikor a láncok fele egymáshoz kapcsolódik, a másik fele pedig szabad állapotban van, azaz k=1:

$T={\frac {dH^{0}}{dS^{0}}}-273,15$

Egy egyszerű hurok olvadáspontját a következőképpen számítjuk ki . DNS-duplex esetén figyelembe kell venni az egyes szálak koncentrációját (mólban, M). Így, ha [A] és [B] az A és B molekulák koncentrációja, akkor a láncok összkoncentrációja, C, megegyezik az összegükkel, [A] + [B]. $T_{m}(K)={\frac {dH^{0}}{dS^{0}}}$

Feltételezzük, hogy mindkét lánc koncentrációja azonos [A] = [B] = C/2. Ebben az esetben

$T_{m}(K)={\frac {dH^{0}}{dS^{0}+R\cdot \ln({\frac {C}{f}})))$

ahol f = 4. Önkomplementer oligonukleotid esetén [A 0 ] = C, majd f = 1. Ezt az olvadáspontot csak akkor határozzuk meg, ha a molekulák fele egymáshoz kötődik.

Egy önkomplementer oligonukleotid esetében k = 1/[At] ezért:

$T_{m}={\frac {dH^{0}}{dS^{0}+R\ln([At])))-273,15$

Nem komplementer duplex esetén, ha [At] ≥ [Bt], k = 1/([At] - [Bt]/2), a Tm a következőképpen kerül kiszámításra:

$T_{m}={\frac {dH^{0}}{dS^{0}+R\ln([At]-{\frac {[Bt]}{2))))}-273,15$

ahol [At] a domináns szál (általában a PCR primer) moláris koncentrációja, [Bt] pedig az alacsony koncentrációjú szál (genomiális DNS) moláris koncentrációja.

Az olvadáspont számítása

A G, H és S termodinamikai paraméterek ΔG, ΔH és ΔS növekményeit a legközelebbi szomszéd modell alapján számítjuk ki. A DNS másodlagos szerkezetének pontos előrejelzése a hibridizáció során dinamikus programozási algoritmusok segítségével minden lehetséges termodinamikai paraméter adatbázisát igényli minden egyes komplementer bázispárra, valamint az összes variánsra a nukleotid eltéréseknél, szabad végekre, hajtűkre és hurkokra vonatkozóan. A rövid oligonukleotidok kiszámításának termodinamikai képlete termodinamikai paramétereken – S entrópia és H entalpia – alapul, mind a 10 négy nukleotid kombinációjára vonatkozóan (1. táblázat). Az 1. táblázat a legközelebbi szomszédok (NN) termodinamikai paramétereit mutatja nukleotidpárok esetén 1 M NaCl koncentrációnál.

A Tm (°С) kiszámításához az egyes párok összes Gibbs-szabadenergia-értékét egy nukleotidos lépésekben összegzik:

ΔG összesen = ΔG kezdeti + ΔG szimmetria + ∑ΔG + ΔG AT végén

5'-CGTTGA-3'	= ΔG kezdeti + ΔG szimmetria +	CG+GT+TT+TG+GA+AT vége
3'-GCAACT-5'		GC CA AA AC CT

ΔG elméleti = 1,96 + 0 - 2,17 - 1,44 - 1,44 - 1,00 - 1,45 - 1,30 + 0,05

ΔG elméleti = -5,35 kcal/mol

Az entrópia (ΔH = -43,5 kcal/mol) és az entalpia (ΔS = -122,5) növekedését hasonló módon számítjuk ki:

$T_{m}={\frac {-43,5\cdot 1000}{-122,5+1,9872\ln({\frac {0,0004}{4))))}-273,15=35,8$

Sok DNS-duplexnek versengő egyszálú szerkezete van. Ez eltolja a rendszer egyensúlyát, és ennek eredményeként T m értéke kisebb lesz, mint a képlet által megjósolt érték.

A T m kiszámításának általános képlete az oldatban lévő só korrekciójával a következő:

$T_{m}={\frac {\Delta H\cdot 1000}{dS+R\ln({\frac {C}{4)))+0,386(L-1)\ln([K^ {+}])}}-273,15$

ahol L az oligonukleotid hossza, R a gázállandó (1,987 cal/K mol), c az oligonukleotid koncentrációja (általában 2x10 −7 M), [K + ] a káliumionok koncentrációja mólokban (általában 5x10 −2 M).

1. táblázat: Termodinamikai paraméterek a legközelebbi szomszédokhoz (NN) nukleotidpárokhoz 1 M NaCl koncentrációnál [3] , [4]

Párok sorrendje (5'-3'/3'-5')	$\Delta H$ ° kcal/mol	$\Delta S$ ° cal/(mol K)	$\Delta G$ ° 37 kcal/mol
AA/TT	-7.6	-21.3	-1.00
AT/TA	-7.2	-20.4	-0,88
TA/AT	-7.2	-20.3	-0,58
CA/GT	-8.5	-22.7	-1.45
GT/CA	-8.4	-22.4	-1.44
CT/GA	-7.8	-21.0	-1.28
GA/CT	-8.2	-22.2	-1.30
CG/GC	-10.6	-27.2	-2.17
GC/CG	-9.8	-24.4	-2.24
GG/CC	-8.0	-19.9	-1,84
megindítás, inicializálás	+0,2	-5.7	+1,96
végpár AT	+2.2	+6,9	+0,05
szimmetria korrekció	0.0	-1.4	+0,43

Egyetlen hiba a duplexben

A komplementer nukleotidpárok legközelebbi szomszéd modellje kiterjeszthető olyan párokra is, amelyek nem komplementer nukleotidokat tartalmaznak. Kimutatták, hogy a nem komplementer bázispárok stabilitása csökkenő sorrendben csökken:

GC > AT > G G > G T ≥ G A > T T ≥ A A > T C ≥ A C ≥ C C

A guanidin G a legkeresettebb bázis, mivel a legerősebb bázispárokat és stabil párokat is alkot nem komplementer bázisokkal (G·G, G·T és G·A). Másrészt a citozin C a leginkább megkülönböztető bázis, mivel a legstabilabb komplementer párokat és instabil párokat alkot nem komplementer bázisokkal (T·C ≥ A·C ≥ C·C) [5] , [6] .

Lásd még

Jegyzetek

↑ Wallace RB, Shaffer J., Murphy RF, Bonner J., Hirose T., Itakura K. Szintetikus oligodezoxiribonukleotidok hibridizálása phi chi 174 DNS-hez: az egyetlen bázispár eltérésének hatása // Nucleic Acids Res : folyóirat. - 1979. - 1. évf. 6 , sz. 11 . - P. 3543-3557 . doi : 10.1093 / nar/6.11.3543 .
↑ Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz. Oligonukleotidok olvadáspontja pcr körülmények között: Mg 2+ , dezoxinukleotid-trifoszfát és dimetil-szulfoxid koncentrációk legközelebbi szomszédos korrekciói az alternatív empirikus képletekkel összehasonlítva // Clinical Chemistry : Journal. - 2001. - Vol. 47 , sz. 11 . - P. 1956-1961 . Az eredetiből archiválva : 2012. szeptember 1.
↑ SantaLucia JJ, Hicks D. A DNS szerkezeti motívumainak termodinamikája // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure : folyóirat . - 2004. - 20. évf. 33 . - doi : 10.1146/annurev.biophys.32.110601.141800 .
↑ SantaLucia JJ A polimer, a súlyzó és az oligonukleotid DNS legközelebbi szomszédos termodinamikájának egységes képe // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America : Journal . - 1998. - 1. évf. 95 , sz. 4 . - P. 1460-1465 . - doi : 10.1073/pnas.95.4.1460 . — PMID 9465037 .
↑ Peyret N., Seneviratne PA, Allawi HT, SantaLucia JJ . A belső AA, CC, GG és TT eltérésekkel rendelkező DNS-szekvenciák legközelebbi szomszédos termodinamikája és NMR-je // Biokémia : folyóirat. - 1999. - 1. évf. 38 . - P. 3468-3477 . - doi : 10.1021/bi9825091 .
↑ Allawi HT, SantaLucia JJ Thermodynamics and NMR of internal GT mismatches in DNA // Biochemistry : Journal. - 1997. - Nem. 36 . - P. 10581-10594 . doi : 10.1021 / bi962590c .